1株微生物絮凝剂产生菌的分离、鉴定与絮凝剂的成分分析

李娜 范祎立 李雪

摘要：从活性污泥中筛选分离得到产微生物絮凝剂的菌株G1-3。经形态观察、生理生化特性分析以及基于16S rDNA系统进化分析，该菌株鉴定为交替单胞菌属（Alteromonas）。该菌株能在特定培养基中产生一种白色絮状沉淀，其产率为2.4 g/L，且该絮状胞外产物对高岭土悬液的絮凝率可达93.06%。经呈色反应分析，该产物主要成分为多糖和蛋白质，其中多糖含量为31.38%，蛋白质含量为16.52%。通过高效液相色谱分析，该胞外产物主要由天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸等17种氨基酸，以及葡萄糖、核糖、半乳糖等10种单糖组成。

关键词：微生物絮凝剂;产絮菌;分离;鉴定;成分分析

中图分类号： X172  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）13-0288-05

絮凝技术是污水处理中效率高、应用广泛且成本低廉的常用方法之一。在含有悬浮颗粒（>1.0 μm）和胶体物质（1.0～1.0 μm）水体的处理过程中，絮凝剂能与这些颗粒物质及色素、重金属离子等污染物结合，形成较大絮凝体沉降至水底，以净化水体[1]。而微生物絮凝剂是利用生物技术，通过微生物发酵、分离提取而得到一种新型、高效、价廉的新型水处理絮凝剂[2]。与传统絮凝剂相比，微生物絮凝剂的二次污染小、安全性高、易被微生物降解、对环境友好，应用领域比其他絮凝剂宽泛[3]，使得其成为当下开发研究的重点。

本研究从活性污泥中筛选出1株生物絮凝剂产生菌 G1-3，该菌在肉汤培养基中产生一种特殊的胞外产物，呈白色絮状，该产物具有优良的絮凝特性。本研究通过形态特征、生理生化特性及基于16S rDNA系统进化分析，对该菌进行菌株鉴定，并对白色絮状沉淀物进行成分分析，旨在为微生物絮凝剂提供一种新材料，扩大应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 絮凝剂产生菌G1-3，由笔者所在实验室从活性污泥中分离、筛选所得，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，编号为CGMCC No：14457。

1.1.2 培养基 肉汤培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，固体培养基琼脂添加量为20.0 g，H2O 1 000 mL，pH值为7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

PDA固体培养基：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH值自然，121 ℃条件下灭菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 微生物絮凝剂产生菌的筛选 取天津市某污水处理厂的活性污泥，取合适浓度的经无菌水稀释的稀释液分别在肉汤固体培养基和PDA固体培养基平板上涂布，于37 ℃培养24 h。挑选其中形态各异的单菌落进行分离纯化，将纯化后的菌株接种于100 mL肉汤培养基中，于37 ℃、200 r/min摇床培养20 h，备用。

在100 mL量筒内加入0.4 g高岭土、4 mL 1%的CaCl2溶液、2 mL菌株发酵液，在200 r/min转速快速搅拌5 min，然后80 r/min，慢速搅拌10 min，静置一段时间，测上清液在 550 nm 处的吸光度，根据吸光度计算絮凝率。计算公式为

μ=（A-B）/A×100%。

其中，μ表示絮凝率，A表示参照上清液的浊度，B表示加入发酵液絮凝之后上清液的浊度[4]。

1.2.2 菌株形态观察 将菌株接种于肉汤固体培养基上，通过3区划线得单菌落，观察其形态。

扫描电镜下观察菌株G1-3的微观形态：2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L PBS清洗3～4次，1% OsO4固定，0.1 mol/L PBS清洗3～4次，分别用50%、70%、80%、90%、100%乙醇，体积比为2 ∶ 1的乙醇与醋酸戊酯、体积比为1 ∶ 1的乙醇与醋酸戊酯依次脱水，纯戊酯脱水30 min，临界点干燥，喷金，于扫描电镜下观察[5]。

1.2.3 胞外絮状产物成分分析 样品的多糖定性采用莫氏试验、斐林试验，蛋白质定性采用茚三酮试验、双缩脲反应，糖的定量测定采用苯酚-硫酸法，蛋白质定量测定采用考马斯亮蓝法，具体操作参见文献[6]。

1.2.4 高效液相色谱分析氨基酸与单糖 发酵液中的白色絮状物5 000 r/min离心经3次无菌水离心、洗涤，用真空冷冻干燥器干燥，取固体，经水解预处理后，采用高效液相色谱法分析其中的氨基酸与单糖组成。

1.2.4.1 单糖组成测定 称取冻干的样品2 mg，加入 2 mol/L 三氟乙酸溶液0.5 mL，在120 ℃条件下水解 120 min，氮吹仪吹干。向水解干燥后得到的单糖样品中加入溶于无水甲醇、0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）试剂和0.3 mol/L NaOH溶液各0.5 mL，充分混匀后，水浴70 ℃反应30 min。冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl 0.5 mL，充分混匀，加入0.5 mL氯仿，充分震荡萃取，离心后用0.22 μm滤膜过滤后上机。

1.2.4.2 氨基酸组成测定 取一定质量样品于20 mL水解管中，加入16 mL 6 mol/L的盐酸溶液，真空脱气30 min，充氮封管，110 ℃下水解22～24 h，冷却后定容至50 mL。取1 mL水解液于小瓶中，真空脱酸抽干，加入1 mL 0.02 mol/L 盐酸溶液，充分溶解。精密量取上述溶液 500 μL，置于5 mL塑料离心管中，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL，混匀，加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液 25 μL，混匀，室温放置1 h后，加2 mL正己烷，剧烈振摇，放置10 min，取下層溶液用0.22 μm的水相膜滤膜过滤后上机分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

经固体平板划线分离，从活性污泥中得到5株菌株，经纯化、培养后，发现其中1株菌能在液体培养基中产生一种白色絮状沉淀（图1）。以对高岭土悬浊液的絮凝活性为指标，该絮状沉淀的絮凝率可达93.2%，且该菌絮凝特性稳定，将该菌命名为G1-3。

2.2 形态观察

G1-3菌株在肉湯固体培养基上呈白色圆形不透明菌落，其表面光滑、有黏性、边缘整齐，菌落大小为1～2 d/mm。通过扫描电镜观察菌株G1-3表面形态呈椭圆状，一端较圆，一端较尖（图2）。

2.3 G1-3的生理生化特征

对菌株G1-3进行生理生化分析，根据VITEK全自动微生物检测系统的分析，菌株G1-3的生理生化特征见表1。菌G1-3可利用葡萄糖为唯一碳源生长，但不能利用麦芽糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖等作为唯一碳源生长;在生长过程中，能产生H2S，且L-脯氨酸芳胺酶、L-苹果酸盐同化为阳性。鉴定结果表明，G1-3菌株的形态和生理生化特性与交替单胞菌属较为一致。

2.4 16S rDNA序列测序

对菌株G1-3测序，经过提取DNA、PCR扩增、连接转化等操作，应用BLAST程序、NCBI数据库里的信息进行同源性搜索，进行分子生物学鉴定，绘制出系统进化树见图3。根据Blast结果，G1-3属于γ-变形菌纲（Gammaproteo bacteria）交替单胞菌属（Alteromonadales），与Alteromonadales bacterium DN3-1亲源关系最近。

2.5 G1-3菌株的生长特性

将菌株G1-3接种至100 mL肉汤培养基中，于 200 r/min 3 ℃条件培养，测定菌株G1-3菌体在2、4、6、8、10、12、24 h的生长情况。根据发酵液在波长600 nm处的吸光度，制得该菌株生长曲线，由图4可知，G1-3仅培养 6 h就呈现指数生长，培养至18 h达到稳定期。

采用干重法，测定菌株G1-3菌体在肉汤培养基中生长2、4、6、8、10、12、24 h时菌株胞外絮状产物的产量。胞外产物较菌株生长晚2 h，培养至8 h时开始快速生成，而至22 h就基本停止，产量在此时达最高，为2.4 g/L。且当培养超过 48 h 时，发酵液中无该白色絮状物，该胞外产物被分解。

2.6 絮凝率测定

根据来源不同，生物絮凝剂可分为3类[7]：微生物细胞，如某些细菌、酵母;微生物细胞提取物，如酵母细胞壁的葡聚糖;微生物细胞代谢产物。为探究该菌株絮凝活性成分的分布情况，对比发酵液、胞外絮状产物、菌细胞悬液、去菌体上清液对高岭土悬浊液的絮凝效果。由图6可知， 胞外产物对高

岭土的絮凝效率高达93.06%，而发酵液原液只有 65.48%，菌细胞悬液以及去菌体上清液的絮凝率仅为10%左右，这充分说明G1-3菌株的絮凝特性与菌体细胞无关，主要由其细胞代谢产物产生。

该絮凝菌产生的生物絮凝剂为白色絮状物，存在于菌体外的培养液中，由微生物分泌到胞外。根据絮凝机理，这些胞外产物可能与水中的杂质通过吸附架桥作用、电中和作用、卷扫作用等[8-10]对水中杂质进行絮凝沉降，以达到水质澄清目的。

2.7 成分分析

2.7.1 外形观察 G1-3菌株的白色絮状物在培养过程中，沉淀聚集在一起，肉眼观察为半透明膜状（图7）。经真空冷冻干燥后，呈乳白色疏松层叠状，在电子显微镜下进行扫描观察，可以观察到絮凝物质呈现折叠膜状结构（图8）。

2.7.2 蛋白质与糖定性定量分析 根据文献报道，当下生物絮凝剂的化学组成可分为以下几类[11]：糖类物质，多肽、蛋白质和DNA，脂类物质，目前已发现的以多糖类物质为主，脂类最少。为探究G1-3菌株胞外絮状产物的成分，对其进行分析。蛋白质定性试验时，样品在茚三酮试验中出现蓝紫色，结果呈阳性;且在双缩脲试验中，出现紫玫瑰色，呈阳性，确定G1-3胞外絮状物中含有蛋白质。糖定性试验时，样品在莫氏试验中出现紫红色环，为阳性，在斐林试验中，无红色或黄色的氧化亚铜沉淀生成，可认定该G1-3胞外絮状产物中含有多糖，但还原糖含量微弱。

根据考马斯亮蓝试验结果，测定样品中蛋白质含量为16.52%;根据苯酚-硫酸试验，测定其总糖含量为31.38%。上述结果表明，该产物以糖类物质为主。

2.7.3 氨基酸与单糖的分析 样品经水解预处理后，通过高效液相色谱分析其氨基酸含量（表2）。经水解后，发现该胞外产物含有17种氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，达 1.993 g/kg，而亮氨酸和谷氨酸分别为1.908、1.760 g/kg，精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸的含量均达 1.000 g/kg 以上。

采用高效液相色谱分析单糖含量，由表3可知，经水解后，发现该胞外产物含有10种单糖，以葡萄糖、核糖、半乳糖为主，其含量明显高于其他糖类，葡萄糖含量高达 428.37 mg/kg，而核糖与半乳糖含量分别为 270.59、224.95 mg/kg。

3 结论

从活性污泥中分离得到1株生物絮凝剂产生菌 G1-3，经形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列鉴定，其属于交替单胞菌属（Alteromonadales）。

关于G1-3菌株絮凝活性成分的分布，以高岭土絮凝率为指标，其胞外产物絮凝率为93.06%，其发酵液原液絮凝率较低，且菌细胞悬液以及去菌体上清液无絮凝特性。

生物絮凝剂的化学性质：茚三酮显色试验呈蓝色，双缩脲反应呈阳性;莫氏反应中浓硫酸与样品试剂混合液分界面有清晰的紫环出现。表明G1-3菌株的胞外絮状产物中含有多糖和蛋白质，根据试验，多糖含量明显高于蛋白质含量，糖与蛋白质比为1.9 ∶ 1。

G1-3菌株的白色絮状产物经分离、真空冷冻干燥后，呈乳白色疏松层叠状，经高效液相色谱分析，該白色絮状沉淀中含17种氨基酸，以天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸、精氨酸为主，含10种单糖，以葡萄糖、核糖、半乳糖为主。

参考文献：

[1]封 培，王世梅，周立祥. 生物絮凝剂产生菌的分离鉴定及其在饮用水除浊上的作用[J]. 环境科学学报，2009，29（8）：1666-1671.

[2]赵 凤，张蔚萍，胡庆华. 微生物絮凝剂的絮凝机理及应用研究[J]. 环境与可持续发展，2009（2）：6-8.

[3]孙鹏轩. 微生物絮凝剂的研究进展及应用现状[J]. 环境保护与循环经济，2013（1）：53-55.

[4]王 雪. 生物絮凝剂混菌发酵条件优化及动力学分析[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2009.

[5]孙镇平，李 佳，刘洪红，等. 不同处理技术对环境扫描电镜下细菌原始形态的影响[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版），2013（1）：41-43.

[6]王 薇. 产絮菌合成生物絮凝剂特性及絮凝成分解析[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2009.

[7]马 放，段姝悦，孔祥震，等. 微生物絮凝剂的研究现状及其发展趋势[J]. 中国给水排水，2012，28（2）：14-17.

[8]董晓斌. 新型生物絮凝剂的研究与应用[J]. 甘肃联合大学学报（自然科学版），2006，20（1）：52-54.

[9]Li Y M，Li Q，Hao D K，et al. Characterization and flocculation mechanism of an alkali-activated polysaccharide flocculant from Arthrobacter sp. B4[J]. Bioresource Technology，2014，170：574-577.

[10]Kumar C G，Joo H S，Choi J W，et al. Purification and characterization of an extracellular polysaccharide from haloalkalophilic Bacillus sp. I-450[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，34：673-681.

[11]王 兰，唐 静，赵 璇. 微生物絮凝剂絮凝机理的研究方法[J]. 环境工程学报，2011，5（3）：481-488.