内侧隔核胆碱能神经元与GABA能神经元参与慢性神经病理性疼痛*

江颖颖 周萌萌 伊 鸣

（1首都医科大学 北京市神经外科研究所，北京100070；2北京大学神经科学研究所；3北京大学基础医学院神经生物学系；4教育部／国家卫生计生委神经科学重点实验室，北京100191）

疼痛是由实际或潜在的组织损伤所引起的令人不愉快的感觉和经历，包含感觉、情绪、认知和社会成分[1]。急性疼痛是机体的一种自我保护机制，避免受到更多伤害，但是疼痛慢性化后会带来感觉、情绪、认知等困扰。严重的慢性疼痛甚至会危及生命[2]。因此研究疼痛，特别是慢性痛的产生及相关调控机制对提高生活质量非常重要。

目前临床上针对慢性痛病人主要采取的治疗措施包括阿片类镇痛药、针灸、神经电刺激、神经阻滞等介入手段、以及音乐等心理治疗手段[3]。但这些手段并不能从根本上治疗疼痛，并且带来很多不良反应，比如吗啡耐受及可能成瘾等问题[4]。所以研究疼痛的产生、发展机制对治疗疼痛具有非常现实的临床意义。

内侧隔核(medial septum, MS)脑区位于胼胝体下方、侧脑室之间，两侧在中线处合并为一个整体[5]。MS接受来自脊髓背角的神经元间接输入并投射到海马、皮层等结构，是大脑同步化上行通路的关键节点[6,7]。MS参与多种重要的生理过程，包括感觉运动整合、空间认知、焦虑、学习记忆、睡眠、恐惧等[5,6]。另外，MS包含胆碱能神经元、GABA能神经元和谷氨酸能神经元，其中数目最多的是胆碱能神经元，约占60%～70%，其次是GABA能神经元，约占20%～30%[8]。

但是MS是否参与慢性神经病理性疼痛以及MS内的不同类型神经元对慢性神经病理性疼痛的作用是否一致并不清楚。因此本研究重点关注MS内的两大类神经元：胆碱能神经元和GABA能神经元在慢性神经病理性疼痛中的作用。采用特异的化学损毁方式分别损毁MS内的胆碱能神经元以及GABA能神经元，之后建立坐骨神经部分神经损伤(spared nerve injury, SNI)模型，采用von Frey hair检测损毁组与对照组大鼠的机械缩足阈值的变化，并且在特异损毁胆碱能神经元后采用条件位置厌恶(conditioned place aversion, CPA)评估SNI神经病理性疼痛引起的情绪变化。

本研究重点关注内侧隔核内的两种主要神经元胆碱能神经元和GABA能神经元在慢性神经病理性疼痛中的作用，这对疼痛由外周神经传入中枢神经的机制具有非常重要的作用。

方 法

1.实验动物

成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重为240～260 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供。每笼2～3只大鼠，自由饮食、饮水。12 h昼夜节律交替，其中8:00～20:00为黑暗环境。所有的实验程序都遵循国际疼痛研究协会的研究和伦理问题的指导方针。所有的行为学实验都是双盲。实验大鼠分为4组，每组7～11只。分别为：胆碱能神经元假损毁加SNI组，胆碱能神经元损毁加SNI组，GABA能神经元假损毁加SNI组，GABA能神经元损毁加SNI组。

2.实验方法

（1）胆碱能神经元损毁：采用192 IgG-saporin(SAP)（Advanced Targeting Systems，美国）药物特异损毁内侧隔核胆碱能神经元[9]。首先用1%戊巴比妥钠（瑞尔欣德科技有限公司，中国北京）麻醉大鼠，剂量为0.55 ml/100 g。大鼠深度麻醉后，头部剃毛备皮，然后将大鼠固定在立体定位仪上（瑞沃德生命科技有限公司，中国深圳）。用75%酒精消毒手术区域。沿正中线切开头皮，暴露颅骨。以前囟为原点，前囟前(anterior-posterior, AP) 0.6 mm，中线旁开(medial-lateral, ML) 0 mm，钻开颅骨直至硬脑膜出现，然后轻挑硬脑膜，暴露脑表面，此过程防止出血及碰触脑组织。用微量注射针（上海高鸽工贸有限公司）吸取0.5 μl 192 IgG-saporin（浓度为 0.35 μg/μl）或者生理盐水 (saline)，以前囟为原点，将微量注射针定位于MS，坐标为AP: 0.6 mm，ML: 0.0 mm, DV: 6.8 mm，然后以0.1 μl/min速度微量注射药物，持续5 min，待药物注射完后，留针5 min，防止药物随针道扩散，微量注射器应及时洗净。用医用缝合线缝合被切开的头皮，最后用碘伏和医用酒精消毒以防伤口感染[10]。

（2）GABA能神经元损毁：已有文献表明采用海人酸(kainic acid, KA) （Sigma-Aldrich，美国）药物特异损毁内侧隔核内的GABA能神经元，而不影响胆碱能神经元[11]，使用的KA浓度为1 μg/μl，体积为0.9 μl注射方法及坐标同胆碱能神经元损毁。

（3）SNI神经病理性疼痛模型：首先，用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，待大鼠深度麻醉后，对其左后腿进行备皮并用75%酒精消毒，然后沿着垂直于左腿方向切开大腿根部皮肤，之后用镊子钝性分开靠近切口方向的肌肉组织，找寻坐骨神经三根分支，其中最细的神经为腓肠神经，保留此神经。另外两根较粗的神经分别是胫神经和腓总神经。用玻璃分针小心分开这三根神经，用结扎线（北京光兴伟业商贸有限公司）分别结扎胫神经和腓总神经，然后在远心端离结扎线3 mm处剪断这两根神经并在神经断处剪去约2 mm的神经，此举是为了防止剪断的神经重新愈合。用玻璃分针将神经沿着原来的方向理顺，缝合肌肉和皮肤。最后用碘酒和医用酒精消毒伤口，防止感染。对照组大鼠，除了不分离剪断神经外，其余操作同模型组[12,13]。

（4）机械缩足阈值测定：在测试前三天，将大鼠放入测量板上进行适应。测量时间点分别为SNI手术前及术后3、7、14、21、28天。根据Chaplan等报道的方法，机械痛阈值由50%缩足阈值(paw withdrawal threshold, PWT)所反映。将大鼠放入金属网上，用透明玻璃罩(18 cm×8 cm×8 cm)限制大鼠活动，适应约30 min，待大鼠梳理和探索活动基本结束后，用von Frey hair（0.41、0.70、1.20、2.00、3.63、5.50、8.50和 15.10 g）（Stoelting, Wood Dale, IL, 美国）刺激大鼠左后足底外侧皮毛交界处。将纤维丝弯曲成S形，并保持6～8 s，观察大鼠是否出现缩足反应。阳性反应包括抬足、舔足、甩足。首先从中等强度的纤维丝(2.0 g)开始，采用“up and down”方法进行。当某一力度的纤维丝刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻较大力度的纤维丝；如出现阳性反应，则给予相邻较小力度的纤维丝刺激。两次刺激间隔时间至少为5 min，以避免反复刺激使大鼠敏化。测试结果结果记录在8行6列的表格中，阳性反应用“O”表示，阴性反应用“X”表示，大鼠第一次出现阳性反应后换行记录，之后每测试一次，无论反应如何均换行记录，直至将表格的6列填满。50%缩足阈值的计算公式为：

其中Xf 为初次应用von Frey hair纤维的力度(2.0 g)的 log 值，δ为相邻 von Frey hair纤维力度log 值之间差值的平均值（即 0.224），k为阳性和阴性反应类型的查表值[14,15]。15.1 g是本法可能达到的最大 50%缩足阈值，0.25 g是本法可达到的最小 50%缩足阈值。

（5）条件位置厌恶(conditioned place aversion,CPA)检测：大鼠条件位置厌恶所使用的设备是由一个中间箱和两个相邻的条件箱组成，三箱之间的门互相贯通（瑞沃德生命科技有限公司，中国深圳）。中间箱的长宽高为10 cm×25 cm×30 cm，条件箱的长宽高为30 cm×25 cm×30 cm。两个条件箱内的图案和地板构成不同，一个条件箱的四壁覆盖黑纸板，地板由钢丝网构成，另一份条件箱的四壁覆盖白纸板，地板由玻璃条构成。测试一共分为四天。第一天（预测试），将接受SNI手术28天后的大鼠放入中间箱，让其在行为箱中自由活动40 min，记录分别在两个条件箱的时间，去除有明显位置偏爱的大鼠，如在某一条件箱停留的时间大于总时间的70% (1 680 s)的大鼠将被淘汰。同时去除过于活跃或呆滞的大鼠。第二天和第三天（条件化训练），当大鼠进入黑色条件箱，则每隔3 min，用15.1 g的von Frey hair刺激左后脚脚掌皮毛交界处，时间为40 min。第四天（测试）重复第一天的实验，记录每只大鼠在两个条件箱的时间。关于CPA的评价指标选择的是CPA评分。CPA评分的计算方式是用第一天在黑色行为箱中的时间减去第四天在黑色行为箱中的时间[16]。

（6）免疫组织化学：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，剪开腹部皮肤，暴露心脏，灌流用针头经心室心房进入主动脉，剪开心耳。首先灌流生理盐水约400 ml，以最大速度进入心脏，迅速冲干净动物体内的血液，防止血液在血管内凝固，影响灌流效果。之后换上冷4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)固定组织，约需300 ml。根据灌流效果适当增加PFA用量。前1/3的PFA快速进入动物体内，后2/3降慢速度，让PFA缓慢渗透进入动物组织。灌流完毕，取动物脑组织，并放在PFA中，在4 ℃冰箱中后固定约12 h。固定之后，依次换上20%、30%蔗糖溶液对脑组织进行脱水处理。脱水过后用包埋剂（Leica，德国）包埋脑组织并迅速冷冻组织。之后在冰冻切片机中进行冠状面切片，切片厚度为30 μm，保存内侧隔核脑片。

将脑片放于磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)中漂洗3×5 min，然后把脑片放于3%的双氧水中1 h灭活脑片本身的过氧化物酶。此过程注意避光并完整展开脑片，然后用PBS漂洗3×5 min，将脑片放入10%羊血清中，室温封闭打孔1 h。用胆碱能神经元标志物：乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)或者GABA能神经元标志物小清蛋白(parvalbumin, PV)抗体在4℃冰箱孵育脑片24～36 h，其中ChAT抗体(AB18736,Abcam, 英国)的浓度为1:200，PV抗体(SAB4200545,Sigma, 美国)浓度为1:500。然后用PBS漂洗3 ×5 min后，进行二抗孵育，二抗是中杉金桥二步法免疫组化检测液，根据一抗来源选择不同的二抗，室温孵育1～1.5 h；PBS漂洗3×5 min，之后用3-二氨基联苯胺(diaminobezidin, DAB)染色液（A液:B液 = 1:20）孵育脑片约5 min，根据脑片着色深浅做出适当调整；然后裱片，将贴有脑片的载玻片放于37 ℃烤箱中烤2～3 d，之后进行梯度酒精脱水，封片，放于显微镜（Leica 倒置荧光显微镜，DMI 4000B）明场模式下观察或照相[17,18]。

3.统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行统计分析，针对缩足阈值的评估，采用双因素方差(two-way ANOVA)分析。针对CPA数据分析采用的是非配对t检验(un-pairedttest)或配对t检验(pairedttest)。数据以均数±标准误()表示。P＜ 0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1.损毁MS胆碱能神经元缓解SNI引起的神经病理性疼痛感觉

首先在内侧隔核注射胆碱能神经元特异的损毁药192 IgG-saporin (SAP)，注射生理盐水作为对照，注射两周后，用von Frey hair检测损毁组(SAP)和对照组(Saline)两组大鼠的机械缩足阈值(PWT)，结果发现两组大鼠的基础缩足阈值并没有差异（SNI 0天）（见图1D），表明损毁内侧隔核胆碱能神经元并不影响大鼠生理痛。之后在两组大鼠左后肢建立SNI神经病理性疼痛模型，结果发现损毁组在SNI后的14、21天的缩足阈值明显增加（group effect:F(1,95)= 7.03,P＜ 0.001; time effect:F(5,95)= 63.95,P＜ 0.001; interaction:F(5,95)= 2.36,P＞ 0.05; two-way ANOVA with Bonferroni's post-test, 见图1D）。表明损毁组大鼠神经病理性疼痛减轻。

在行为学实验结束后将大鼠灌流取材，对内侧隔核内的胆碱能神经元进行DAB染色以此鉴定损毁是否成功。结果发现损毁组内侧隔核内的胆碱能神经元数目明显减少（t= 6.47,P＜ 0.001, un-pairedttest，见图1A-C）。表明损毁成功，所有大鼠均进行染色，损毁不成功的大鼠，其行为学数据全部删除，以排除损毁不成功带来的干扰。

图1 损毁内侧隔核内的胆碱能神经元能明显缓解大鼠SNI神经病理性疼痛(EM)Fig.1 Lesion of cholinergic neurons in medial septum significantly relieved neuropathic pain in SNI rats (EM)

2.损毁MS胆碱能神经元缓解SNI引起的厌恶情绪

除了评估内侧隔核胆碱能神经元对SNI引起的痛感觉的变化，我们用CPA检测SNI引起的厌恶情绪的变化。首先比较对照组大鼠第一天和第四天在黑色行为箱的时间，结果发现第四天在黑色行为箱的时间明显小于第一天(t= 9.12,P＜ 0.001, pairedttest，见图2A)，说明CPA模型成功建立。之后比较损毁组与对照组的CPA评分，结果发现损毁组的CPA评分比对照组少(t= 2.37,P＜ 0.05, un-pairedttest，见图2B)，表明损毁组大鼠对黑色行为箱的厌恶减轻，表明损毁内侧隔核胆碱能神经元能缓解SNI引起的厌恶情绪。

3.损毁内侧隔核GABA能神经元缓解SNI引起的慢性神经病理性疼痛

接下来，为了评估内侧隔核内的GABA能神经元对SNI神经病理性疼痛的影响，已有文献证明海人酸(kainic acid, KA)能特异损毁GABA能神经元，而不影响胆碱能神经元[11]，因此我们在内侧隔核内注射GABA能特异的损毁药(KA)或生理盐水，在注射两周后，用von Frey hair检测损毁组和对照组的基础缩足阈值(PWT)，结果发现损毁组与对照组的PWT并没有差异，表明损毁GABA能神经元并不影响生理痛。之后建立SNI神经病理性疼痛模型，结果发现损毁组在SNI后的14、21、28天缩足阈值明显升高（group effect:F(1,116)= 5.98,P＜ 0.001;time effect:F(5,116)= 65.75,P＜ 0.001; interaction:F(5,116)= 3.87,P＜ 0.001; two-way ANOVA with Bonferroni's post-test, 见图3D），表明损毁内侧隔核内的GABA能神经元能明显减轻SNI引起的神经病理性疼痛。

在行为学实验结束后，将大鼠灌流取材，对内侧隔核内的GABA能神经元进行DAB染色，结果发现损毁组的GABA能神经元数目明显减少（t=5.72,P＜ 0.001, un-pairedttest, 见图 3A-C），说明损毁成功。所有大鼠均进行染色，将损毁不成功的大鼠的所有行为学数据删除，避免损毁不成功带来的干扰。

讨 论

已有研究表明内侧隔核接受来自脊髓背角深层的投射[19]，并且P物质受体阳性的神经元会直接投射到内侧隔核[20]。此外在外周接受伤害性刺激时，内侧隔核中68%的神经元都会被激活[21]。在大鼠足底注射福尔马林，能显著增加内侧隔核的c-Fos阳性神经元数目[22]。这些结果表明内侧隔核参与疼痛。另外内侧隔核内的神经元投射广泛，比如投射到海马、前扣带回皮质、前额叶皮质等结构，而这些结构与疼痛的发生和维持密切相关[23]。

图2 损毁内侧隔核胆碱能神经元能明显缓解大鼠SNI引起的厌恶情绪(EM)Fig.2 Lesion of cholinergic neurons in medial septum significantly relieved aversion induced by SNI (EM)

之前的研究表明内侧隔核胆碱能神经元参与慢性炎症痛[10]，而是否参与神经病理性疼痛以及内侧隔核内的GABA能神经元是否也参与神经病理性疼痛并不清楚。我们采用特异的化学损毁方式分别损毁内侧隔核内的胆碱能神经元与GABA能神经元，观察其对SNI引起的神经病理性疼痛的影响。结果发现损毁内侧隔核内的胆碱能神经元能明显改善SNI引起的痛感觉和痛情绪。关于内侧隔核内的胆碱能神经元调控慢性神经病理性疼痛的机制可能与内侧隔核内的胆碱能神经元广泛投射到皮层，如前扣带回(ACC)和海马等结构有关[23]，通过调节下游神经元兴奋性来调控疼痛。

另外损毁内侧隔核内的GABA能神经元也能明显缓解SNI神经病理性疼痛。另外之前有研究表明使用海人酸(KA)损毁特异内侧隔核内的GABA能神经元能明显缓解福尔马林引起的厌恶情绪(formalin-induced conditioned place avoidance, F-CPA)[24]，这些说明内侧隔核内的GABA能神经元参与疼痛及相关情绪。关于GABA能神经元参与疼痛的具体机制需要进一步阐明，由于内侧隔核本身的三种不同神经元之间会相互投射，形成环路[8]，因此，推测内侧隔核的GABA能神经元参与疼痛可能与其内部环路有关。

因此本结果证明了内侧隔核内的两大类神经元均参与慢性神经病理性疼痛。我们这一结论为临床上如深部脑电刺激等介入手段治疗疼痛提供了新的操作部位，为减轻疼痛提供了新的治疗方向。

不过本实验具有一定局限性，虽然化学药物能特异损毁某类神经元，但是损毁区域周围的神经元会存在一定的代偿作用，目前并不清楚这类代偿作用的机制以及参与生理过程的程度，所以之后将采用更精确的方式，比如光遗传等手段进一步验证这一结果，以便更好的为临床治疗提供依据。