不同哈蟆油加工品中1-甲基海因含量的比较

徐 阳，李明宇，李加俊，鲍慧玮

(1.长春医学高等专科学校药学与食品学院，吉林 长春 130031；2.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

哈蟆油(Oviductus Ranae)系蛙科动物中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid.)雌蛙的输卵管干制品[1]，纯天然、无污染、全营养，已然成为中国东北的珍贵滋补品[2-4]。哈蟆油的食用历史可追溯到满族入关之前，只有在满族大祀或大宴等重要活动时，哈蟆油才会作为最圣洁的食品出庖供盘。而在民间，哈蟆油有多种加工方法，比如蒸、炖、烘干等[5-7]，这些加工方法对哈蟆油中主要活性成分的影响尚不明确。因此，本文以2015版《中华人民共和国药典》一部中哈蟆油的鉴别指标——1-甲基海因为研究对象[8-11]，通过HPLC法建立含量测定方法，并对不同哈蟆油加工品中1-甲基海因的含量进行比较，为哈蟆油加工方法的深入研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪、Chemstation工作站(美国安捷伦科技有限公司)；KQ-250型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1004B型电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；AB135-S型电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

哈蟆油(吉林省鼎源特产经贸有限公司，批号：20170801)，经由长春中医药大学中药鉴定教研室肖井雷副教授鉴定为正品，符合《中华人民共和国药典》2015版一部项下相关规定；1-甲基海因(中国药品生物制品检定所，批号：111836-201102)。

甲醇(色谱纯，Fisher有限公司)；磷酸(分析纯，北京化工厂)；纯净水(杭州娃哈哈股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 哈蟆油加工品的加工方法

不同哈蟆油加工品的加工方法见表1。

表1 不同哈蟆油加工品的加工方法

1.2.2 色谱条件

色谱柱为AlltimaTMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为纯净水，进样量为10 μL，检测波长为215 nm。

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 对照品溶液

取1-甲基海因对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mL含0.102 mg的溶液，作为1-甲基海因对照品母液；精密吸取1-甲基海因对照品母液1 mL，置10 mL量瓶中，制成1mL含10.2 μg的溶液，即得。

1.2.3.2 供试品溶液

取清炒、焦炒、水煮、清蒸、烘干及未加工的哈蟆油适量，粉碎，称取约5 g，加入8倍量甲醇超声提取30 min(功率250 W，频率40 kHz)，过滤，同法提取3次，收集、合并滤液；旋转蒸发溶剂，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2 实验结果

2.1 系统适应性及专属性试验

分别取对照品溶液、清炒哈蟆油供试品溶液，按照上述色谱条件进行分析，结果如图1和图2，待测色谱峰与相邻色谱峰基本分离，理论塔板数按1-甲基海因峰计算均不低于3 000。

2.2 线性关系试验

精密吸取上述配制好的1-甲基海因对照品母液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释定容到刻度，摇匀，使质量浓度分别为2.04、4.08、10.20、20.40、40.80、102 μg/mL。将6种溶液分别注入高效液相色谱仪中，按照色谱条件进行测定。绘制标准曲线(图3)，得回归方程y=42.195x+0.087 3(R2=0.999 6)，结果表明，1-甲基海因质量浓度在2.04～102 μg/mL范围线性关系良好。

图1 1-甲基海因对照品色谱图

图2 清炒哈蟆油供试品色谱图

图3 1-甲基海因线性关系曲线

2.3 精密度试验

精密吸取1-甲基海因对照品溶液，按照谱条件重复进样6次，记录色谱峰面积，计算得到1-甲基海因色谱峰面积的RSD值为1.37%，表明该仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

取同一批清炒哈蟆油样品(批号：190501)6份，制备供试品溶液进行测定，记录色谱峰面积，计算得到1-甲基海因含量的RSD值为1.86%，表明该方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取清炒哈蟆油供试品溶液，置于室温，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h时进行测定，记录色谱峰面积，计算得到1-甲基海因色谱峰面积的RSD值为1.66%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 加样回收试验

精密称取已知含量的清炒哈蟆油样品6份，每份约2.56 g，每份均加入5 mL的1-甲基海因对照品溶液(6.67 μg/mL)，制备供试品溶液，按照色谱条件进行测定，计算得到1-甲基海因的平均回收率为99.76%，RSD值为1.45%(表2)，表明该方法准确度良好。

2.7 不同哈蟆油加工品中1-甲基海因的含量测定

取5种不同的哈蟆油加工品及未加工品，制备供试品溶液，按照色谱条件进样测定，采用外标法计算1-甲基海因含量，结果见表3。

表2 1-甲基海因加样回收率试验

表3 不同哈蟆油加工品中1-甲基海因的含量

3 讨论

3.1 检测波长的选择

本文采用二极管阵列(DAD)检测器进行全波长扫描，得到1-甲基海因在215 nm有较大的吸收峰，且与邻近色谱峰分离度较好，且基线平稳，故选择在该波长下进行检测。

3.2 流动相体系的选择

根据文献报道，本文预先选择了甲醇、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸和水6种流动相体系进行比较[12-14]，考虑到待测色谱峰与相邻色谱峰的分离情况及峰形效果，故选择100%水作为流动相进行洗脱。

3.3 供试品制备方法的选择

本文分别比较了不同提取方法(超声提取法、回流提取法和浸渍法)、不同提取溶剂(甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、水)和不同提取时间(15 min、30 min、45 min、60 min)对哈蟆油加工品中1-甲基海因提取率的影响，发现采用甲醇超声提取30 min时，1-甲基海因提取较完全，且不随着提取时间的延长而增加，故选择此条件处理供试品。

3.4 含量测定结果分析

本文通过对哈蟆油5种不同加工品中相关活性成分1-甲基海因的含量进行测定。发现100℃烘干4 h与未加工哈蟆油样品中1-甲基海因的含量差别较小，水煮和清蒸的加工方法使1-甲基海因的含量略有下降，清炒和炒焦的加工方法使1-甲基海因的含量明显地下降，且随着炒制时间的增加，1-甲基海因的含量随之骤降，这些因素都可能影响哈蟆油的相关药效作用。

4 结论

本文建立的HPLC测定不同哈蟆油加工品中1-甲基海因含量的方法操作简单、便捷、重复性良好。考虑到哈蟆油不同的加工方法还会影响到微生物活性、水溶性蛋白含量等方面，因此仍需对加工方法进行进一步推敲，以确保达到哈蟆油药效的最佳发挥。