USP33在结直肠癌组织中的表达及与Wnt/β-catenin通路的关系

（义乌市中心医院 肛肠外科，浙江 义乌322000）

结直肠癌的预后与分期关系密切，出现转移的结直肠癌患者5年生存率较低，严重影响患者健康[1-2]。泛素特异性蛋白酶33（USP33）为泛素特异性蛋白酶家族成员之一，在多种恶性肿瘤中表达异常。其在恶性肿瘤的侵袭、迁移中发挥重要作用[3]，可通过多种信号通路参与恶性肿瘤的侵袭、迁移过程[4]。Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌的发生、发展中具有重要作用，抑制Wnt/β-catenin信号通路对结直肠癌具有抗癌作用[5-6]。本文对结直肠癌组织中USP33的表达及与Wnt/β-catenin通路的关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月—2017年12月义乌市中心医院肛肠外科结直肠癌组织标本及对应的癌旁组织标本各90例。其中，男性55例，女性35例；平均年龄（61.25±4.56）岁；肿瘤直径（2.37±1.34）cm；分化程度：低分化36例，中分化25例，高分化29例；Dukes分期：A期24例，B期23例，C期27例，D1期 16例 ；浸润深度 ：≥T243例，＜T247例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移50例；肝转移42例，无肝转移48例。纳入标准：所有患者行首次手术治疗；经病理证实为结直肠癌。排除标准：术前行放化疗等其他治疗。本研究通过本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂兔抗人 USP33 多克隆抗体、鼠抗人USP33多克隆抗体、鼠抗人β-catenin多克隆抗体及鼠抗人C-myc多克隆抗体等购自美国Abcam公司，ECL购自美国Sigma公司。

1.2.2 免疫组织化学染色将结直肠癌组织和癌旁组织石蜡切片脱蜡至水，置微波炉加热5 min修复抗原，用10%山羊血清封闭15 min，加入USP33、β-catenin及C-myc一抗（1∶400）过夜孵育。加入生物素标记二抗孵育1 h；加入辣根酶标记链霉卵白素孵育15 min，DAB显色，苏木精-伊红染色，盐酸酒精返蓝，梯度酒精脱水；经透明、封片后拍照观察。结果判断：根据切片阳性细胞着色强度和阳性细胞比例判断，细胞质出现棕褐色颗粒为阳性，选择5个400高倍视野观察，细胞着色强度评分。无着色：0分；浅黄色：1分；棕黄色：2分；棕褐色：3分。阳性细胞比例评分，阳性细胞比例0%：0分；阳性细胞比例≤10%：1分；阳性细胞比例＞10%～50%：2分；阳性细胞比例＞50%～70%：3分；阳性细胞比例＞70%：4分。细胞着色强度和阳性细胞比例评分乘积≥5分为阳性，＜5分为阴性。

1.2.3 Westernblotting 取结直肠癌组织和癌旁组织标本匀浆，用蛋白裂解液提取总蛋白，经电泳、转膜，脱脂奶粉封闭 2 h，加入一抗 USP33（1 ∶ 1 000）、β-catenin（1∶250）及C-myc（1∶250）过夜孵育。以β-actin为内参照，加入二抗（1∶1 000）孵育45 min，ECL显色，Image J图像分析软件对蛋白条带灰度值进行分析。USP33、β-catenin及C-myc蛋白相对表达量以USP33、β-catenin及C-myc蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织中USP33、β-catenin及C-myc的表达

USP33主要在细胞质中表达；β-catenin主要在细胞质和细胞核中表达；C-myc主要在细胞核中表达。结直肠癌组织中USP33阳性16例，β-catenin阳性61例，C-myc阳性57例。癌旁组织中USP33阳性58例，β-catenin阳性14例，C-myc阳性15例。结直肠癌组织与癌旁组织中USP33（17.78% VS 64.44%）、β-catenin（67.78% VS 15.56%）及 C-myc阳性率（63.33% VS 16.67%）比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=40.479、50.491和40.833，均P=0.000）；结直肠癌组织中USP33阳性率低于癌旁组织，而β-catenin、C-myc阳性率高于癌旁组织（P＜0.05）。见图1。

2.2 结直肠癌组织中USP33表达与临床病理特征的关系

Dukes分期中A、B期与C、D期，有淋巴结转移与无淋巴结转移，以及有肝转移和无肝转移患者USP33阳性率比较，经χ2检验，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Dukes分期C、D期，有淋巴结转移及有肝转移结直肠癌组织中USP33阳性率低于A、B期，无淋巴结转移及无肝转移者。不同年龄、性别、肿瘤直径、分化程度及浸润深度结直肠癌组织中USP33阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 结直肠癌组织与癌旁组织中USP33、β-catenin及C-myc蛋白相对表达量比较

结直肠癌组织和癌旁组织中USP33、β-catenin及C-myc蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；结直肠癌组织中USP33蛋白相对表达量低于癌旁组织，而β-catenin、C-myc蛋白相对表达量高于癌旁组织（P＜0.05）。见表2和图2。

2.4 结直肠癌组织中USP33与β-catenin、C-myc蛋白的相关性

结直肠癌组织中USP33与β-catenin、C-myc蛋白呈负相关（r=-0.612 和-0.564，均P=0.000）。

图1 结直肠癌组织和癌旁组织中USP33、β-catenin及C-myc蛋白的表达（免疫组织化学染色×400）

表1 不同因素结直肠癌组织中 USP33 表达阳性率比较 [n =90，例（%）]

表2 结直肠癌组织和癌旁组织中 USP33、β-catenin及 C-myc 蛋白相对表达量比较（n =90，±s）

表2 结直肠癌组织和癌旁组织中 USP33、β-catenin及 C-myc 蛋白相对表达量比较（n =90，±s）

组别 USP33 β-catenin C-myc结直肠癌组织 0.12±0.04 0.29±0.07 0.64±0.15癌旁组织 0.37±0.06 0.11±0.03 0.14±0.05 t值 32.890 22.422 30.000 P值 0.000 0.000 0.000

图2 结直肠癌组织和癌旁组织中 USP33、β-catenin及C-myc蛋白的表达

3 讨论

结直肠癌患者的治疗方法是以手术为主、辅以放化疗的综合治疗。治疗后可在一定程度上提高患者生存时间，但结直肠癌总体预后仍较差。因此，延长患者生存时间、提高疗效仍是目前迫切需要解决的问题[7]。结直肠癌的发生、发展是一个多基因变异、多因素及多阶段的过程，和多个癌基因及抑癌基因引起的基因突变关系密切。研究证实，结直肠癌的发生、发展和细胞代谢、周期及信号转导通路等生命活动的紊乱和失调关系密切，原癌基因激活和抑癌基因失活是恶性肿瘤发生的最重要的遗传基础[8-9]。探索恶性肿瘤基因变异和表达具有重要意义。

USPs家族属于半胱氨酸蛋白酶家族成员，USPs家族成员繁多，多种USPs家族成员和恶性肿瘤的发生、发展关系密切。USP33是USPs家族成员，USP33可以与VHL抑癌蛋白相互作用，因此又成为VHL相关性去泛素化酶1[10]。USP33在恶性肿瘤的发生、发展中发挥关键性作用。JIA等[11]发现，USP33在甲状腺癌组织中表达下调，与甲状腺癌的淋巴结转移关系密切，是甲状腺癌预后的独立生物标志物。低表达UPS33甲状腺癌患者的复发风险升高，USP33可减弱甲状腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。UPS33可能为甲状腺癌潜在的治疗靶点和新的生物标志物。LIU等[12]研究发现，UPS33在结直肠癌组织中低表达，低表达患者的复发风险高、总体预后差，为晚期结直肠癌的新型预后标志物。过表达UPS33可抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移。本研究对义乌市中心医院结直肠癌组织中UPS33的表达进行研究发现，结直肠癌组织中UPS33表达下调，与结直肠癌的Dukes分期、淋巴结转移及肝转移有关。Dukes分期、淋巴结转移及肝转移可反映结直肠癌的病情严重程度。本研究结果表明，UPS33可能参与结直肠癌的发生、发展过程，与患者疾病严重程度有关。

UPS33可通过多种信号通路参与恶性肿瘤的发生、发展过程，如USP33通过抑制SLIT2/ROB01信号通路，抑制肺腺癌细胞的侵袭、转移[13]；USP33通过介导Slit-Robo信号通路，抑制结肠直肠癌细胞的迁移[14]；Wnt/β-catenin信号通路在恶性肿瘤中常被激活，与恶性肿瘤侵袭、转移关系密切[15]；SOX15可通过下调Wnt/β-caten信号通路，影响结直肠癌细胞生长[16]；miRNA-155通过调节Wnt/β-catenin信号通路，促进结直肠癌SW-480细胞侵袭[17]；Capn4通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进结肠直肠癌细胞增殖[18]。β-catenin和C-myc是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员[19-20]。本研究结果发现，结直肠癌组织中USP33蛋白水平低于癌旁组织，而β-catenin、C-myc蛋白水平高于癌旁组织，结直肠癌组织中USP33蛋白与β-catenin、C-myc蛋白呈负相关，表明USP33的结直肠癌中的作用可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，结直肠癌组织中USP33蛋白与β-catenin、C-myc蛋白呈负相关，USP33可能通过Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌中发挥作用。对USP33和Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌中发生、发展中的具体作用，尚需在接下来的研究中进行细胞及动物实验进一步明确。UPS33可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与结直肠癌的发生、发展，UPS33有望成为结直肠癌的治疗靶点和潜在生物标志物。