藏药秦紫消癖丸质量标准研究

汪晶　杨忠辉　彭毛才让　陈惟思　索果佳　黄一平　曹鹏　项欠本

【摘 要】 目的：建立藏药秦紫消癖丸的质量标准。方法：采用显微鉴别法对秦艽花、塞北紫堇进行鉴别;薄层色谱法对制剂中秦艽花、塞北紫堇进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对制剂中龙胆苦苷、獐牙菜苷进行含量测定，色谱柱为X-Bridge C18柱 （ 250 mm×4.60 mm，5 μm ）;流動相为甲醇-0.4%甲酸水（22∶78）;流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长为245 nm。结果：TLC斑点清晰，分离度好，阴性无干扰;龙胆苦苷、獐牙菜苷分别在质量浓度24.2950 ～ 194.3600 μg/mL（r=0.9997）、6.6950 ～53.5600 μg/mL（r=0.9997）范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为100.04%（RSD=1.52%），100.02%（RSD=2.59%）。结论：研究建立的方法稳定性、重复性好，可用于秦紫消癖丸的质量控制。

【关键词】 秦紫消癖丸;质量标准;龙胆苦苷;獐芽菜苷;原阿片碱

【中图分类号】R29 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）13-0052-05

藏族医药具有民族特色，是我国传统医药的重要组成部分。藏药秦紫消癖丸系青海省海南州藏医院治疗乳腺增生的临床经验方，由秦艽花、塞北紫堇、冬葵叶、水柏枝等5味药材组成，具有调补冲任、化痰软坚、祛瘀散结等功效，主要用于乳腺增生症，症见乳房疼痛及乳房肿块[1]。该制剂传统剂型为水泛丸，制备工艺繁琐，周期长，且微生物限度难以控制[2-4]，而改进后的浓缩丸将冬葵叶、水柏枝进行水提取后与其他三味药材细粉混匀，采用塑制法制丸，生产效率大大提高，服用量减小，为适应中药制剂制造规范化、标准化，为了提高药品质量标准，保证临床疗效及用药安全，试验进行秦紫消癖丸质量标准研究，分别采用显微鉴别、薄层色谱鉴别、HPLC等方法对制剂进行质量控制，以期为民族药医疗机构制剂的开发及质量控制提供可靠的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 LC高效液相色谱仪公司（四元泵、自动进样器、DAD检测器、柱恒温箱;美国安捷伦）;ZF-20C暗箱式紫外分析仪;AT 201型1/10 万以及 XP6 型 1/100万电子天平电子天平（瑞士梅特勒公司）;KQ-5200E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）;AK-55型流水式粉碎机、AW-96型台式全自动制丸机（温岭市奥力中药机械有限公司）;Millipore型纯水器（美国Millipore公司）;硅胶G、GF254薄层板（青岛海洋化工厂）。

1.2 材料 龙胆苦苷对照品（ 批号： 110770-201515，中国食品药品检定研究院）;獐牙菜苷对照品（批号：MUST-17073009，成都曼思特生物科技有限公司）;原阿片碱对照品（批号为： 110853-201404，中国食品药品检定研究院）。甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。秦紫消癖丸样品（批号：20170601、20170602、20170603，江苏省中医药研究院）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取本品加少量水溶散后，过滤，滤渣再用水合氯醛加热透化，稀甘油封片，镜检，记录显微特征。结果：花粉粒类圆球形，表面雕纹不明显，直径36 μm[5]，有3个萌发孔（秦艽花）。叶表皮细胞不规则形，垂周壁平直或弯曲，气孔不定式，副卫细胞4～5个（塞北紫堇）。显微特征如图1。

2. 2 TLC鉴别

2.2.1 秦艽花 取藏药秦紫消癖丸1.0g，研细（过4号筛），置于100mL三角锥形瓶中，加入甲醇25mL，超声处理30min，将溶液摇匀，用滤纸滤过，制备成供试品溶液[6-8];另取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每 lmL含1mg的溶液，作为对照品溶液。按处方工艺制备得不含秦艽花丸剂，以相同方法制成阴性对照品溶液[9]。照《中国药典》2015 年版四部通则0502薄层色谱法试验[10]，吸取对照品溶液1μL，供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（ 20∶2∶1 ）为展开剂，预饱和15min，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。由图2可知，供试品色谱在与对照品色谱相应位置上有显相同颜色斑点，阴性对照无干扰[11-13]。

2.2.2 塞北紫堇 取藏药秦紫消癖丸5.0g，研细（过4号筛），置于三角锥形瓶中，加二氯甲烷-甲醇-浓氨试液 （ 5∶1∶0.1 ）混合溶液40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液[14-16]。另取原阿片碱对照品，加甲醇制成每lmL含1mg 的溶液，作为对照品溶液。按处方工艺制备得不含塞北紫堇丸剂，以相同方法制成阴性对照品溶液[17-18]。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（ 10∶8∶2∶0.3 ）为展开剂，预饱和15min，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液[19]。供试品色谱在与对照品色谱相应位置上有显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性 采用X-Bridge C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇-0.4%甲酸水（22∶78）;流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;采用DAD紫外检测器检测，检测波长为245 nm;进样量10 μL，理论塔板数按龙胆苦苷计算，应不低于4000[20-22]。

2.3.2 溶液制备 对照品溶液的制备：称取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解，定容，即得0.4859 mg/mL龙胆苦苷贮备液。称取獐牙菜苷对照品适量，精密称定，甲醇溶解并定容至量瓶中，即得0.1339 mg/mL獐牙菜苷贮备液。分别精密吸取上述溶液5 mL于10 mL量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，即得含龙胆苦苷0.2429 mg/mL、獐牙菜苷0.0669 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：将丸剂研细，取约0.4 g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，超声处理30min，取出，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，取少量溶液于离心管中高速离心，上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤過，即得。

阴性对照溶液制备：按处方比例称取除秦艽花以外的药材，按本品制备工艺及供试品制备方法制成阴性对照溶液。

2.3.3 专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，在“2.3.1”项下色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果表明，龙胆苦苷及獐牙菜苷色谱峰在供试品、对照品溶液色谱图中保留时间一致，阴性供试品在此处未有吸收峰，表明在上述HPLC测定条件下，无阴性干扰，建立的方法专属性良好。结果见图4。

2.3.4 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.5、1、2、3、4mL置于5mL量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μL，分别注入高效液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定。以对照品浓度对峰面积进行线性回归分析，得到回归方程分别为龙胆苦苷Y=11.787X+15.009（r=0.9997）、獐牙菜苷Y=17.073X-10.094（r=0.9997），线性范围分别24.295～194.360、6.695～53.560μg·mL-1，结果表明线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液（含龙胆苦苷0.0972mg/mL、獐芽菜苷0.0268mg/mL）10μL，按上述色谱条件连续进样6次，测得龙胆苦苷与獐牙菜苷峰面积RSD分别为1.08%、1.70%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取同一批样品，研细，按供试品制备方法平行制备6份，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得龙胆苦苷、獐牙菜苷平均含量分别为6.0510，2.0307mg/g， RSD分别为2.90% 、2.31%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24h进样测定，测得龙胆苦苷、獐牙菜苷峰面积的RSD分别为2.28%、 2.57%，表明在室温条件下，供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取已测定的样品0.2g，精密称定，共6份，分别精密加入龙胆苦苷与獐牙菜苷混合对照品溶液（含龙胆苦苷0.2429mg/mL、0.0669mg/mL） 5mL，按“2.3.2”项下供试品制备方法制备样品，进样量为10μL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.3.9 样品含量测定 分别取3批秦紫消癖丸样品，精密称定，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算龙胆苦苷和獐芽菜苷含量，测定结果见表2。参考3批样品含量测定结果，暂将样品含量限度定为本品含龙胆苦苷不得低于5.4 mg/g，獐芽菜苷不得低于1.8 mg/g。

3 讨论

藏药秦紫消癖丸是根据传统藏医药理论，采用现代制剂技术将秦紫消癖丸制成浓缩丸，减小了服用量，提高了患者的依从性;降低微生物污染几率;提高生产效率，促进民族药现代化的发展。

秦紫消癖丸中秦艽花的花粉粒、塞北紫堇的气孔易检出，其特征明显，但专属性较差，因此未列入质量标准中。在鉴别秦艽花的TLC试验中，以乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1）、乙酸乙酯-甲醇-水（20∶2∶1）不同比例展开剂比较斑点分离情况后选择分离效果更好的乙酸乙酯-甲醇-水（20∶2∶1）为展开条件;在鉴别塞北紫堇TLC试验中，比较不同展开系统环己烷-乙酸乙酯-二乙胺（16∶3∶1）、正己烷-乙酸乙酯-三乙胺（16∶3∶2）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3），确定了以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3）为展开系统的分离效果最佳，选择改良碘化铋钾试液为显色剂，显色清晰。在TLC鉴别试验中水柏枝与冬葵叶阴性有干扰，故未列入质量标准。

在HPLC含量测定时，通过全波长扫描发现龙胆苦苷在245 nm和275 nm均有较大吸收，獐牙菜苷在245 nm处有最大吸收，且无阴性干扰，所以选择245 nm处为检测波长。供试品溶液制备过程中比较了回流提取与超声提取，结果发现对秦艽花中龙胆苦苷的提取并无显著性区别，考虑到超声提取操作更加简便，选择超声提取。提取溶剂比较了30%、50%、70%、100%浓度甲醇，发现30%、50%、100%浓度的甲醇提取的龙胆苦苷峰均拖尾，70%甲醇提取时龙胆苦苷峰形好，提取率更高，因此选择70%甲醇为提取溶剂。比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.4%甲酸水等多种流动相体系，发现以甲醇-0.4%甲酸水为流动相洗脱时分离效果最好;本文的研究工作为秦紫消癖丸的质量控制提供了依据。

参考文献

[1]钟建青， 惠军. 乳腺增生丸质量标准研究[J]. 药学研究， 2016， 35（1）：33-36.

[2]李玲，杨骏，王冰，等. 左归浓缩丸质量标准的研究[J].中华中医药学刊， 2016，14（4）：791-794.

[3]詹文强， 王炯， 尚佳，等. 杜仲腰痛浓缩丸制备工艺优化[J].中国实验方剂学杂志， 2013， 19（5）：71-73.

[4]王青晓， 高晓洁， 李宇辉，等. 香砂养胃丸（浓缩丸）的质量标准提高研究[J].药学杂志， 2016，27（13）：213-222.

[5]黄璐琦. 中草药与民族药药材图谱 [M]. 北京： 北京大学医学出版社， 2005.

[6]胡一晨， 万丽， 张艺，等. 秦艽花的质量标准规范化研究[J]. 中药与临床， 2011， 2 （2）：16-18.

[7]张兴旺， 文怀秀， 陶燕铎，等. 藏药秦艽花的质量标准研究[J]. 时珍国医国药， 2011， 22（7）： 1649-1650.

[8]赵昱玮， 于淼， 司学玲，等. 炎热清片中龙胆苦苷的薄层鉴别及含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志， 2013， 19（3）：118-120.

[9]刘颖， 胡琴， 陶志国. 龙胆泻肝颗粒质量标准研究 [J]. 中成药， 2013， 35 （12）： 2661 -2666.

[10]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015.

[11]胡一晨， 万丽， 张艺，等. 秦艽花的质量标准规范化研究[J]. 中药与临床， 2011， 02 （2）：16-18.

[12]张兴旺， 文怀秀， 陶燕铎，等. 藏药秦艽花的质量标准研究[J]. 时珍国医国药， 2011， 22（7）： 1649-1650.

[13]赵昱玮， 于淼， 司学玲，等. 炎热清片中龙胆苦苷的薄层鉴别及含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志， 2013， 19（3）：118-120.

[14]普巴扎西， 歐洋， 张朝阳， 等. 赛北紫堇的质量标准研究[J]. 华西药学杂志， 2015， 30 （4）：487-489.

[15]许灿新.延胡索及其伪品的鉴别研究 [D]. 广州：广州中医药大学， 2016.

[16]张静， 周浓， 祁俊生，等. HPLC同时测定不同产地延胡索中的6种生物碱[J]. 华西药学杂志， 2016， 31（4）：415-419

[17]刘颖， 胡琴， 陶志国. 龙胆泻肝颗粒质量标准研究[J]. 中成药， 2013， 35 （12）： 2661-2666.

[18]叶菊， 孙立卿， 确生， 等. 四种紫堇属藏药化学成分预实验及其生物碱含量测定 [J]. 西北民族大学学报（自然科学版）， 2017， 38（3）： 42-47.

[19]吴蕾蕾， 刘翔， 卢叶， 等. 藏药矮紫堇质量标准研究[J]. 时珍国医国药， 2017，14（10）： 2374-2377.

[20]刘姝静， 才谦. 不同采收期龙胆中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的变化研究 [J]. 现代药物与临床， 2017， 32（10）：1828-1831.

[21]李荣娇， 杨凤仙， 袁绿益，等. HPLC法测定西藏秦艽花与川西秦艽花中7种成分的量[J]. 中草药， 2015， 46（8）：1227-1230.

[22]唐晓莹， 王晓玲. HPLC-ESI-MSn法分析西藏秦艽花和川西秦艽花中的7种成分[J]. 西南民族大学学报（自然科学版）， 2017， 43（1）：44-49.

（收稿日期：2019-04-09 编辑：刘斌）