黄芪桂枝五物汤减少铂蓄积预防奥沙利铂慢性外周神经毒性机制研究＊

魏国利，顾展丞，李灵常，马 骏，陈 晨，钱 峻，霍介格＊＊

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院 南京 210028；2.江苏省海门中医院 海门 226100；3.江苏省淮安市中医院 淮安 223001；4.江苏省盐城市中医院 盐城 224002；5.南京中医药大学中医学院/中西医结合学院 南京 210023）

奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）作为新一代铂类抗肿瘤药物，是多种消化系统肿瘤化疗的一线推荐用药。慢性外周神经毒性是限制其作用发挥的最主要原因，常导致药物剂量的使用不足甚至化疗中止，影响疗效[1]。奥沙利铂致慢性外周神经毒性（Oxaliplatininduced chronic peripheral neuropathy, OICPN）主要表现为手足末梢麻木、疼痛及感觉异常，符合中医“痹症”范畴[2]。临床中发现黄芪桂枝五物汤可以预防奥沙利铂慢性外周神经毒性[3]。近来研究发现铂蓄积在奥沙利铂慢性外周神经毒性（OICPN）的发病机制中扮演重要角色[4]。本研究通过建立奥沙利铂慢性神经毒性大鼠模型，观察黄芪桂枝五物汤对铂蓄积的影响，探讨黄芪桂枝五物汤预防奥沙利铂慢性外周神经毒性可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性Wistar 大鼠45只（上海斯莱克实验动物中心），SPF 级，体重180-220 g。动物饲养于安静、通风和空气过滤系统的环境中，保持室温20-25℃，相对湿度40% -60% ，自由进食和饮水。为保持动物昼夜生物节律，实验室每日8：00至20：00开灯，20：00至次日8：00 熄灯。本实验严格按照国际疼痛学会（IASP）关于应用清醒动物进行疼痛实验研究纲要的要求实施和完成。

1.1.2 实验药物

生黄芪、桂枝、炒白芍、大枣、生姜均由江苏省中医药研究中药房提供。黄芪桂枝五物汤（生黄芪18 g、桂枝9 g、炒白芍9 g、大枣9 g、生姜9 g）成人处方生药量54 g（前期多次实验结果表明高剂量中药组疗效最佳，故本实验中药组只设高剂量组，2.48g·mL-1），加入10倍量的水煎煮，后浓缩至各剂量所需的体积，4℃保存备用。奥沙利铂（艾恒）注射液，50 mg，批号：12071012，江苏恒瑞医药股份有限公司，5% 葡萄糖注射液100 mL：5 g，批号：2012051801，氯化钠注射液100 mL：0.9，批号：12012091203。

1.1.3 主要实验仪器和试剂

疼痛触觉测试套件（Von frey hairs）购自美国Stoelting公司）普通PCR仪和ABI7500型荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems，电感耦合等离子体发射质谱仪ICP-MS 2000（江苏天瑞仪器）,电镜全波长酶标仪购自Thermo Scientific；尼氏染色液购自Beyotime，RTPCR试剂盒、q-PCR试剂盒购自Thermo Scientific，PCR引物购自Genscript。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药

将45 只健康雄性Wistar 大鼠适应性喂养1 周后，称重，随机分为空白组、奥沙利铂模型组、黄芪桂枝五物汤组，每组15 只。黄芪桂枝五物汤组灌胃给药10 mL·kg-1，每日1 次，空白组、奥沙利铂模型组予0.9% NaCl溶液灌胃（10 mL·kg-1），每日1次。奥沙利铂用药当天，中药于奥沙利铂应用前1 h给药。

1.2.2 奥沙利铂慢性神经毒性模型建立

参照Mihara Y 等[6]的造模方法，将奥沙利铂50 mg溶于25 mL的5% 葡萄糖溶液中，终浓度为4 mg·mL-1，（2 mL·kg-1）现配现用。除空白组第予以腹腔注射5% 葡萄糖注射液2 mL·kg-1外，其余4 组按照4 mg·kg-1，2 mL·kg-1予以腹腔注射奥沙利铂。一周2 次，共4 周（d1，2，8，9，15，16，22，23）。

1.2.3 指标检测

（1）体重：第0、7、14、21、28 d测量大鼠体重。

（2）机械性缩足反射阈值：第0、7、14、21、28 d通过Von Frey试验检测大鼠机械性缩足反射阈值。检测方法：将一个塑料盒子（20×15×20 cm）放到一个金属筛网上，在测试之前先让大鼠适应5 min。选取折力1-15 g Von Frey纤维细丝垂直刺激大鼠后肢足底中间的部分，持续时间为6 s。测定时首先从折力2.0 g 开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻大一级力度的刺激；若出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激。每个折力的Von Frey纤维细丝均连续测定5次，每次刺激间隔30 s，5次当中有3次或3次以上的阳性反应视为有机械痛敏，最大力度为15 g，大于此值时记为15 g。大鼠机械缩足阈值持续下降表示神经毒性的产生。

（3）坐骨神经HE染色：造模第28 d，每组选择3只大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后仰卧固定，注入100 mL PBS，后注入100 mL 4% 的多聚甲醛固定，分离大鼠双侧坐骨神经（从上端开始大概取长度为0.5 cm），将坐骨神经投入预先配好的4% 多聚甲醛固定液中使组织固定。后脱水透明石蜡包埋，切白片HE染色液染色后用中性树胶封片，普通光镜观察测量核仁大小。

（4）背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）尼氏染色：造模第28 d，每组选择3 只大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后仰卧固定，注入100 mL PBS，后注入100 mL 4% 的多聚甲醛固定，分离L4-5 DRG，将DRG 投入预先配好的4% 多聚甲醛固定液中使组织固定。后脱水透明石蜡包埋，切白片尼氏染色液染色后用中性树胶封片，普通光镜观察测量核仁大小。

（5）背根神经节电镜：造模第28 d，每组选择1 只大鼠，麻醉固定，心脏灌注PBS溶液后分离L4-5 DRG，将DRG 切割成0.5-1 mm 的小块，先后给予2.5% 的戊二醛、1% 锇酸中固定后包埋、修片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色，电镜观察细胞微细结构病理改变。

图1 大鼠机体重变化

图2 大鼠机械性缩足阈值变化

图3 大鼠坐骨神经HE染色（1000 X）

（6）背根神经节铂蓄积：造模第28 d，每组选择3只大鼠，麻醉固定，心脏灌注PBS 溶液后分离L4-5 DRG，-80℃保存。检测时给予硝酸消解，再次稀释后采用ICP-MS法检测细胞内铂含量。

（7）qPCR 检测背根神经节OCT2、ATP7A 基因表达：造模第28 d，每组选择3只大鼠，麻醉固定，DRG分离同上，-80℃保存。检测时将标本放入加有1mlTRIZOL的EP管中，在匀浆机上匀浆后加入试剂提取总RNA，1ugRNA 用于cDNA 第一链的合成，PCR 引物序列如下：OCT2-F：5'-CAG AGG AGC TGA ACT ACA CCG T-3'，OCT2-R：5'-ACA GTG GGT CCA CAC AGT CA-3'；ATP7A-F：5'-TAG ACG GCA TGC ATT GTA AAT C-3'，ATP7A-R：5'-TGG ATT TTA CAC CTG GCT TCT T-3'；内 参GAPDH-F：5'-TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT-3',内参GAPDH-R：5'-CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC-3'。RT-PCR:

反应条件25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，反应停止后测cDNA 浓度，稀释10 倍用。qPCR:反应体系：2*SYBR 10 μL ，引物F 1 μL ，引物R 1 μL ，cDNA 2 μL，Water 6 μL，离心进样检测计算RQ值。

1.2.4 统计学方法

采用SPSS17.0 统计软件包进行数据统计学分析，多组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05表示具有统计学意义，P<0.01表示具有显著性统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重变化

与空白组相比，随着奥沙利铂的应用，模型组大鼠开始出现体重下降，第21 d 出现统计学差异（P<0.05），第28 d（P< 0.01）。而黄芪桂枝五物汤不能改善奥沙利铂导致的体重下降（P>0.05）（图1）。

2.2 各组大鼠不同时间机械性缩足阈值变化

与空白组相比，造模第14 d 模型组大鼠开始出现机械性缩足阈值下降（P<0.05）。第21、28 d模型组机械性缩足阈值下降更为明显（P<0.01），而黄芪桂枝五物汤高剂量组未出现明显的机械阈值下降（P>0.05）（图2）。

2.3 各组大鼠坐骨神经病理形态变化

图4 大鼠背神经节光镜油镜图片1000X

图5 大鼠背根神经节电镜2.5K

图6 大鼠背根神经节铂含量

HE染色后光镜下观察坐骨神经（图3），与空白组（A）相比，多次腹腔注射奥沙利铂后，模型组（B：奥沙利铂）大鼠坐骨神经神经纤维排列紊乱。黄芪桂枝五物汤组（C：奥沙利铂+黄芪桂枝五物汤2.48 g·mL-1）神经纤维排列轻度紊乱。

2.4 各组大鼠背根神经节细胞核仁大小变化

尼氏染色后光镜下观察背根神经节（图4），与空白组（A）相比，多次腹腔注射奥沙利铂后，大鼠背根神经节细胞胞质淡然，核仁缩小（黑色箭头指示），模型组（B：奥沙利铂）核仁缩小最明显。黄芪桂枝五物汤组（C：奥沙利铂+黄芪桂枝五物汤2.48 g·mL-1）核仁大小变化轻。

2.5 各组大鼠背根神经节线粒体变化

电镜下观察（图5），与空白组（A）相比，多次腹腔注射奥沙利铂后大鼠背根神经节细胞的线粒体（红色箭头指示）出现肿胀，部分嵴断裂和空泡形成，模型组（B：奥沙利铂）线粒体损伤最明显。黄芪桂枝五物汤组（C：奥沙利铂+黄芪桂枝五物汤2.48 g·mL-1）线粒体有肿胀但无空泡形成。

2.6 各组大鼠背根神经节铂含量

ICP-MS 法定量检测背根神经节内的铂含量（图6），与空白组相比，多次腹腔注射奥沙利铂后大鼠背根神经节细胞内铂含量增加，与慢性外周神经毒性的程度呈正相关，模型组铂含量显著高于空白组（P<0.01），中药组的铂含量均明显低于模型组（P<0.05）。

2.7 背根神经节铂蓄积相关因子OCT2、ATP7A 基因表达

qPCR 结果显示（图7），与空白组相比，模型组大鼠背根神经节细胞OCT2mRNA表达量增加（P<0.05），ATP7AmRNA 表达量无变化（P> 0.05），与模型组相比，黄芪桂枝五物汤组OCT2 mRNA和ATP7AmRNA的表达量均下降（P<0.05）。

3 讨论

图7 大鼠背根神经节OCT2和ATP7A mRNA表达比较

奥沙利铂是临床中广泛应用的化疗药物，其与氟尿嘧啶组成的化疗方案被国内外各大指南一致推荐为结直肠癌术后辅助化疗的标准方案。外周神经毒性限制了其临床应用，奥沙利铂引起的外周神经毒性分为急性和慢性两种，急性神经毒性常发生在奥沙利铂用药后1 周内，一般症状轻微可自行恢复[5]；慢性外周神经毒性是其剂量限制性毒性，一般在应用奥沙利铂2周期以后逐渐出现，随着奥沙利铂累积剂量的增加而加重，4-6周期化疗结束后发生率高达42.1-69% ，临床表现为四肢末端的麻木、疼痛可伴有精细运动障碍，部分患者停药后症状仍可持续数月甚至数年严重影响了患者的生活质量[6-8]。虽然已开展了多种药物防治奥沙利铂外周神经毒性的临床研究，如钙镁合剂、还原型谷胱甘肽、卡马西平、文拉法辛、维生素E、B 族维生素等[9]。但是到目前为止没有任何一种药物被证实可以有效的防治奥沙利铂引起的慢性外周神经毒性。

研究表明铂蓄积是奥沙利铂慢性外周神经毒性产生的重要机制，背根神经节（DRG）是奥沙利铂慢性外周神经毒性主要的伤害靶器官，奥沙利铂进入机体后会优先蓄积在背根神经节内[10]。文献报道，OCT2 和ATP7A 是铂蓄积的关键因子，铂类药物进入机体后，背根神经节细胞通过OCT2 将药物转运至细胞内，通过ATP7A将药物泵出细胞外，二者失衡后导致了铂蓄积，铂蓄积会激活氧化应激、线粒体损伤等，引起DRG神经元细胞损伤，导致DRG 功能异常，产生外周神经毒性[11,12]。体外实验发现给予奥沙利铂处理，过表达OCT2 的HEK293 细胞株铂含量是正常细胞株的28.6倍，体内实验也发现抑制OCT2 的表达可以减少奥沙利铂神经毒性的发生[13]。研究同时也发现绝大多数肿瘤不表达或极少表达OCT2，体内外实验也证实抑制OCT2 的功能，不影响铂类药物的抗肿瘤作用[14,15]。Virginia 等也实验证实ATP7A 表达增加可以促进奥沙利铂流出细胞从而减少其对神经元DNA 损伤的结果[16]。

OICPN 主要表现为手足末梢麻木、疼痛及感觉异常伴或不伴有精细运动障碍，属于祖国医学“痹证”的范畴。《内经·痹论》“其不痛不仁者，病久入深，荣卫之行涩，经络时疏，故不痛，皮肤不营，故为不仁”。肿瘤患者本身存在正气不足，化疗药物属于有毒伤正之品，应用奥沙利铂后会进一步损伤机体正气，导致气血不足，营卫虚弱，气虚则推动无力血行涩滞，血虚则荣养不足，最终四肢末梢经络闭阻不通，筋脉失养，不通、不荣则出现四肢末梢疼痛、麻木等症状。基于此，我们认为OICPN 的中医病机为气血不足，营卫虚弱，经络闭阻。黄芪桂枝五物汤出自张仲景的《金匮要略》，是治疗“痹证”的经典名方，黄芪桂枝五物汤对OICPN预防作用已有大量的文献报道[17,18]。前期我们开展的小样本随机对照临床研究（NCT02590367），结果显示黄芪桂枝五物汤可以预防OICPN 的发生且不影响奥沙利铂的抗肿瘤疗效[19]。

在本实验中我们建立了OICPN 动物模型，结果显示黄芪桂枝五物汤可以拮抗奥沙利铂引起的机械性缩足阈值的下降，预防OICPN 发生。进一步的实验结果也证实黄芪桂枝五物汤可以减少铂蓄积及铂蓄积导致的下游细胞损伤如核仁缩小、线粒体肿胀等。qPCR的结果提示黄芪桂枝五物汤可能是通过下调OCT2表达、上调ATP7A表达，减少背根神经节细胞铂蓄积的。本研究首次从铂蓄积的角度研究中药复方黄芪桂枝五物汤预防奥沙利铂慢性外周神经毒性发生的机制，为临床中的应用提供了依据。但黄芪桂枝五物汤如何调控OCT2h和ATP7A表达尚不清楚，值得进一步研究。