消癌解毒方对H22 荷瘤小鼠血管生成相关因子的影响＊

李 黎，吴勉华，周红光，李沐涵，李文婷，季 漪，马艳霞，雒慧娟

（1.南京中医药大学第一临床医学院肿瘤研究所 南京 210023；2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心 南京 210023；3.南京中医药大学基础医学院 南京 210023）

2018年2月国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据[1]，肝癌已经成为我国继肺癌、胃癌、结直肠癌之后，发病率排名第四的癌症；死亡率居恶性肿瘤第二位。肝癌早期症状不明显，一旦发现，大多属于晚期，目前肝癌的治疗首选手术治疗（肝移植、肝切除），此外介入治疗、消融治疗、化疗、靶向治疗等方法也多为临床应用[2]，但复发率高，根治不彻底，治疗类型有限，存在费用昂贵等方面的问题仍是肝癌治疗中的难题[3]。中医药在肿瘤治疗中正发挥着越来越重要的作用，主要体现在减轻副作用，改善患者症状，提高生存质量等方面[4]。

国医大师周仲瑛教授认为肿瘤的发生主要归结于癌毒致病，正气亏虚，肝癌的主要病理因素为湿热瘀毒结聚，治疗以清化湿热、化瘀解毒为主，在此基础上加用散结消癥之品。消癌解毒方主要有白花蛇舌草、僵蚕、蜈蚣、麦冬等药组成，为周仲瑛教授临床常用经验方；经临床实践证明，本方配合化疗治疗中晚期恶性肿瘤，与单纯化疗相比，合用组患者CD3+、CD4+及NK 活性显著升高，证明使用消癌解毒方配合化疗可显著提高患者抗肿瘤免疫能力，使患者化疗完成率显著提高，生活质量明显改善[5]。H22 肿瘤细胞株属小鼠的肝细胞瘤，1963 年由上海药物研究所引进，变成腹水型瘤株。H22荷瘤小鼠是将腹水型H22 肝癌细胞种与ICR小鼠腋下造成的移植瘤小鼠模型，国内学者对H22 细胞生物特性、免疫学等方面做了深入的研究，其移植瘤模型用于肿瘤研究及药物筛选已经被广泛认可[6]。已有实验研究证明[7]，该方能够通过多通路、多途径影响H22 荷瘤小鼠移植瘤生长，凋亡及移植小鼠的免疫功能，发挥抗肿瘤作用。本实验主要探讨消癌解毒方对肿瘤血管生成的影响，进一步探讨其抗肿瘤的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级ICR 小鼠，雄性，体质量18±2 g。购自南京大学-南京生物医药研究院，实验动物生产许可证SCXK（苏）2015-0001；实验动物使用许可证SYXK（苏）2014-0001。南京市鼓楼医院科研中心提供H22瘤株种鼠。

1.2 实验药品

白花蛇舌草、太子参、蜈蚣、僵蚕等中药购自安徽省亳州市中西药有限公司，由南京中医药大学药学院吴皓教授鉴定，消癌解毒方共81 g，煎煮2 次，第一次煎煮前，加水8 L，浸泡饮片1 h，加热回流提取2 h，收集提取液；提取物残渣冷却降温，加6 L 水，加热回流提取2 h，收集提取液。两次提取液合并，旋转蒸发器浓缩，至含生药量2 g·L-1，-20℃保存；注射用顺铂20毫升/支(齐鲁制药有限公司)。

1.3 主要试剂

Trizol ( 美 国invitrogen，批 号：115596- 026)；Ribonuclease Inhibitor ( 美 国life technology，批 号：c10777000)；MMLV 反转录酶（TAKARA，批号：TRT-101）；qPCR Master Mix（南京诺唯赞，批号：Q111-02/03）；VEGF 抗体、（Santa Cruze，批号：sc-7269）；TGF-β抗体（Cell Signaling Technology，批号：4），MMP2 抗体、CXCL2 抗体（Abcam，批号：ab37150、ab9777）；各引物有上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1；VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2 Elisa 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：EK0541、EK0460、EK0515、EK0542）；

1.4 主要仪器

超微量生化分光光度计（ScanDrop，analytikjena）；稳压稳流电泳仪（DYY-8，北京六一仪器厂）；微型电泳槽（H6-1，上海精益有机玻璃制品仪器厂）；Realtime 实 时 定 量PCR 仪（Quant Studio 5，life technology）；酶标仪（Tecan Spark 10M）。

表1 Realtime-PCR引物列表

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠移植瘤模型制备及分组

H22 荷瘤种鼠由南京鼓楼医院赠送，碘酒消毒腹部，抽取0.2 mL种鼠腹水接种至2只小鼠腹腔，待长出腹水，每鼠抽取0.2 mL，接种至4只小鼠腹腔。无菌条件下抽取所有腹水瘤小鼠的腹水，以无菌生理盐水稀释，离心，重悬，计数，调整细胞浓度至1×108ml-1，每只ICR小鼠右腋下接种0.2 mL的细胞悬液。

2.2 实验分组及给药方法

小鼠接种瘤细胞3 d后，开始分组给药，随机分为空白组，阳性药（即顺铂组），治疗组（即消癌解毒方低、中、高剂量组），每组10只。其中空白组每日灌胃生理盐水，根据《药理实验方法学》换算消癌解毒方给药剂量，阳性药组每日顺铂组腹腔注射（1 mg·kg-1）治疗组每日灌胃低、中、高剂量消癌解毒方（10 g·kg-1、30 g·kg-1、90 g·kg-1）每天给药1次，连续给药10 d。

2.3 移植瘤的肿瘤抑制作用

给药10 d后，次日处死小鼠，分别称取各组小鼠体质量、各组瘤块重量，计算抑瘤率。

抑瘤率（% ）=（空白组瘤体质量－给药各组瘤体质量）/空白组瘤体质量×100% 。

2.4 全基因组表达谱芯片检测

每组取一个瘤体样本，送至上海康成生物工程有限公司，做全集因组表达谱芯片检测。使用Agilent 芯片扫描仪扫描芯片信号，收集数据，数据根据空白组进行标准化，计算各给药组相对于空白组的fold change（实验组标记信号/空白组标记信号），其中fold change ≥2 者标记为表达显著上调基因，Fold change ≤0.5为表达显著下调基因。

表2 消癌解毒方对小鼠H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用(n=10±s)

表2 消癌解毒方对小鼠H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用(n=10±s)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

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表3 STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2全基因芯片检测结果

2.5 各组小鼠血清VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2因子的检测

给药10 d 后，次日处死小鼠，各组小鼠眼眶取血，室温静置2 h，3000 r ⋅min-1离心10 min，收集上清，每组取3个血清样本，按照Elisa试剂盒说明书进行检测。

2.6 各组肿瘤组织STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因的表达

每组随机抽取3个瘤体样本，称量瘤体重量，加入适量的TRIZOL试剂，制备RNA样本；引物设计见表1；使用样品的RNA 进行cDNA 合成；制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板；将配置的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR反应.

2.7 western blot法测定STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2蛋白表达

各组取3个肿瘤组织样本，MP组织处理器破碎各肿瘤组织，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，用裂解缓冲液将各组蛋白稀释至相同浓度，加入一定量的上样缓冲液，并煮沸5 min，10% SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳结束后，采用半干法进行转膜，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2按照说明书1∶1000稀释，4℃孵育过夜，二抗按照说明书1∶5000 稀释，室温孵育2 h，化学发光法曝光条带，采用Image Lab进行条带分析。

3 统计学分析

统计分析采用SPSS17.0 软件进行处理。实验数据以xˉ±s表示，各组间的数据比较采用One-way ANOVA统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 消癌解毒方对H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用

与空白组比较，消癌解毒方低、中、高剂量组、顺铂组H22 荷瘤小鼠移植瘤瘤重降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示消癌解毒方灌胃给药对H22小鼠移植瘤具有较好的抑制作用，空白组瘤体重1.187 ±0.259 g，表示肿瘤模型成功。实验结果见表2。

4.2 全基因组芯片检测结果

本次基因芯片共检测41000 条基因，相关实验结果已经发表在中国中西医结合杂志[7]。对芯片检测结果进行分析发现，与空白组比较，CXCL2、VEGF基因在消癌解毒方低剂量组为表达下调基因，MMP2、TGF-β、CXCL2基因在消癌解毒方中剂量组为表达下调基因，STAT1基因在消癌解毒方的高剂量组为表达上调基因，MMP2、CXCL2基因在消癌解毒方的高剂量组为表达下调基因，各基因的具体上调/下调结果（表3）。

4.3 各组VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2 细胞因子的检测

与空白组比较，消癌解毒方低、中、高剂量组及顺铂组血清VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2细胞因子含量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05），实验结果见表4。

4.4 各组肿瘤组织STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因的表达

与空白组比较，STAT1基因在消癌解毒方各剂量组及顺铂组瘤体中表达上调，VEGF、MMP2、CXCL2基因在各消癌解毒方及顺铂组组瘤体中表达下调，实验结果具有统计学差异（P<0.05，P<0.01），TGF-β基因在消癌解毒方低、中剂量及顺铂组表达显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01），TGF-β在消癌解毒方高剂量组中表达降低，但无统计学意义，实验结果见表5。

表4 消癌解毒方对VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2细胞因子的影响

表5 各组目的基因表达的相对差异(n=

表5 各组目的基因表达的相对差异(n=

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

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4.5 各组肿瘤组织STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2蛋白的表达

Western blot 实验结果显示，与空白组比较，消癌解毒方不同剂量组均可STAT1 蛋白的表达升高，VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2的蛋白表达降低，差异极显著（P< 0.01），各组蛋白条带及分析结果见图1 及表6。

5 讨论

《黄帝内经》中根据临床表现及病因病机，将肝癌据归为中医“癥瘕”、“积聚”、“胁痛”等范畴，国医大师周仲瑛教授认为[8]，正气亏虚为肝癌发病基础，气虚则血瘀，瘀滞日久则结与肋下，形成结块，导致胁痛、胸闷等症；在治疗中周老注重标本兼施，抗癌解毒，扶正驱邪药物同用，临床取得良好疗效。

图1 各组相关蛋白的表达

STAT1 是首先被发现的STATs 家族成员，作为潜在的转录因子，能够被干扰素（IFNs）以及其他多种信号分子激活[9]，STAT1 被激活以后，主要参与细胞的增殖、凋亡，被认为是一种抑癌基因，在肿瘤治疗中，因此STAT1也被认为是一种新的治疗靶点[10,11]。Parkin等[12]学者研究认为，VEGF能够促进血管内皮细胞的增殖，促进肿瘤细胞分化、增殖、迁移能力，增加肿瘤组织氧供应，形成纤维网络结构从而促进肿瘤细胞的迁移，导致肿瘤发生。有研究发现，IFN-γ/STAT1 信号激活，可以抑制VEGF的生物活性，从而抑制血管生成，同时在发展期的胰腺癌研究中发现，STAT1 表达的缺失可以增加VEGF的表达水平，从而促进肿瘤生长，侵袭以及转移[13]。在血管新生早期，基底膜降解，使肿瘤细胞浸润和迁移是必要步骤，VEGF 可通过活化内皮细胞释放蛋白水解酶，从而促进基质降解，促进肿瘤的迅速发展。同时MMPs通过激活、降解细胞外基质，释放更多的VEGF。VEGF 与MMPs 相互作用，迅速促进了肿瘤的发展和侵袭转移。MMP2 降解Ⅳ型胶原最主要的酶，通过降解基质，可以释放更多的生长因子，既促进了MMPs 的合成，也上调了VEGF 的功能[14]。TGF-β是具有生长功能的多肽类细胞因子，以多种形式参与血管生成、细胞分化及转移等。在肿瘤组织中低浓度TGF-β作为血管生成因子促进了肿瘤组织新生血管的形成，调节了血管内皮生长因子的旁分泌功能，促进生成了内皮细胞和毛细血管腔，良好的促进了肿瘤细胞的生长环境[15]，同时TGF-Β可以通过多种途径增强其诱导肿瘤血管生成的作用，因此TGF-β或许也可以成为新的肿瘤治疗靶点[16]。CXC类趋化因子具有促进肿瘤血管生成的作用，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7 和CXCL8，这些趋化因子可直接作用于血管内皮细胞促进血管生成，从而介导肿瘤的生长和转移[17]。实验研究发现，CXCL2 主要在肿瘤及感染的炎症反应期高表达，从而募集更多的中性粒细胞，这些中性粒细胞可以合成和释放大量的与血管生成相关的因子，如血管内皮细胞生长因子等，从而促进肿瘤的发展[18]。

表6 消癌解毒方对H22小鼠移植瘤中相关蛋白表达的影响

对于全基因组芯片结果的分析，主要研究了STAT1基因以及与肿瘤血管生成相关的基因的改变，并挑选了表达差异显著的VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2进行进一步的实验验证。实验结果证明消癌解毒方作用能够上调抑癌基因STAT1及蛋白的表达，降低VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因及蛋白的表达，抑制肿瘤血管生成相关的基因及蛋白的表达。中医对肿瘤的病机认识中，正气亏虚是基础，由此才发生痰、瘀、毒等实质，有学者认为癌毒邪蓄积是肿瘤血管生成的前提，正气虚损是肿瘤血管生成的内在因素，瘀血内结则是其主要病理变化。因此，解毒、扶正、活血等是中医药调控肿瘤血管生成的重要治则，是进一步研究中药抗肿瘤血管生成机制的切入点[19]。本方中蛇舌草、山慈菇具有清热解毒、消痈散结、化痰散结的功效；僵蚕、蜈蚣具有息风止痉的功效，与太子参、麦冬配合有助于肿块的消解，发挥抗肿瘤作用，由于方中发挥抑制血管生成作用的主要物质基础尚不清楚，后续本课题组将进一步深入研究。