锰对意大利蜜蜂幼虫生长发育和抗氧化能力的影响

夏振宇 张卫星 王红芳 刘振国 王颖 胥保华

（山东农业大学动物科技学院，泰安 271018）

1 前言

在蜜蜂的生理代谢中，矿物质的作用非常重要，不仅参与歧化反应，也是调节血淋巴与组织液渗透压的重要因素[1]。微量元素是蜜蜂机体组织中的重要营养物质，微量元素占蜜蜂个体干物质的6.2%~6.7%[2]。在糖饲粮中添加微量元素也能延长蜜蜂工蜂16.5%~32.7%的寿命[3]。

锰是动物体内重要的矿物元素之一，锰能促进动物体内的内分泌活动和提高动物机体免疫功能，还参与动物氧化还原过程[4]。锰不仅仅参与构造动物体内的金属酶，还是许多酶的激活剂[5]。前人研究表明，随着蜜蜂日龄的增长，其体内的锰元素含量会逐渐增加，在蜜蜂饲粮中补充适量的锰会促进蜜蜂的生长发育[6]。因此，有必要按蜜蜂生长发育的需求在人工饲粮中添加微量元素锰。

意大利蜜蜂的生长发育中需要一定水平的锰来满足其需要。为了进一步探明锰对蜜蜂生长发育和生理机能的影响，本研究以意大利蜜蜂为研究对象，通过在蜜蜂幼虫饲粮中添加不同浓度的锰，开展室内幼虫饲养试验，对蜜蜂生长发育、机体生理生化指标以及相关基因表达等进行测定和观察，力求探明锰对蜜蜂的营养作用及机制。

2 材料与方法

2.1 试验动物

意大利蜜蜂。

2.2 试验设计

从姊妹蜂群中移取2日龄（2d）意大利蜜蜂工蜂幼虫1200只，随机分成5组，每组5个重复，每个重复48只幼虫，并置于室内恒温恒湿培养箱中培养，温度为34℃，湿度为50%±5%。其中1组为对照组，饲喂基础饲粮；其余4组为试验组，分别在基础饲粮中添加不同水平的葡萄糖酸锰，添加水平分别为2.00mg/kg、3.00mg/kg、4.00mg/kg、5.00mg/kg，配方如表1所示。分别采集3d、5d、7d幼虫样本，测定生理生化指标和相关基因表达水平；统计各组化蛹率、羽化率。

表1 幼虫人工饲粮配方及锰水平

表2 基因引物序列

2.3 测定指标及相关方法

2.3.1 蜜蜂幼虫生长发育指标的测定

从每试验组中随机选取发育正常的1日龄幼虫120只，每组5个重复，每个重复24只幼虫。从1日龄饲养至7日龄，转移幼虫至化蛹板化蛹，化蛹率为成功化蛹的幼虫数占用于测定幼虫的化蛹率幼虫总数的百分数。继续饲养，直到所有蛹羽化，羽化率为成功羽化的幼虫数占成功化蛹的幼虫数目的百分数。

2.3.2 蜜蜂幼虫体内生理生化指标的测定

用双抗体一步夹心法试剂盒测定蜂体的蛋白质浓度、总抗氧化能力（T-AOC）、含锰超氧化物歧化酶活性（MnSOD）、含锰过氧化氢酶活性（MnCAT）和精氨酸酶活性（Arginase）。4种抗氧化酶活性均用蜂体蛋白质浓度进行校准[7]。

2.3.3 蜜蜂幼虫体内相关基因表达量的测定

用qRT-PCR法检测抗氧化酶相关基因表达量、精氨酸酶基因表达量。目的基因引物设计参考序列来自于NCBI数据库，以β-actin为内参，委托上海生工生物科技有限公司完成，引物序列如表2所示。

2.3.4 数据处理

数据采用SAS 9.2软件进行单因素方差分析，结果表示为平均值±标准差，P<0.05表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 锰对蜜蜂幼虫生长发育的影响

试验结果表明，幼虫人工饲粮中锰的添加水平对蜜蜂化蛹率和羽化出房率的影响不显著（P>0.05），但与对照组相比，幼虫饲粮中锰添加水平为4.00mg/kg时，锰能够提高意大利蜜蜂幼虫化蛹率和羽化出房率。

3.2 锰对蜜蜂幼虫体内生理生化指标的影响

图1 锰对蜜蜂幼虫化蛹率的影响

图2 锰对蜜蜂幼虫羽化率的影响

由图3可以看出，随着饲粮中锰添加水平的升高，幼虫体内的MnSOD活性显著升高（P<0.05）。

由图4可以看出，随着饲粮中锰添加水平的升高，幼虫体内的MnCAT活性显著升高（P<0.05）。

由图5可以看出，随着饲粮中锰添加水平的升高，幼虫体内的T-AOC活性显著升高（P<0.05）。

3.3 锰对蜜蜂幼虫体内相关基因表达量的影响

与对照组相比，当幼虫饲粮中锰添加4.00mg/kg时，幼虫体内的MnSOD基因表达量显著升高（P<0.05）。

锰显著影响不同日龄蜜蜂幼虫MnCAT基因的相对表达量，3日龄幼虫3mg/kg处理组MnCAT基因的相对表达量显著高于对照组和其他处理组（P<0.05）。5日龄幼虫3mg/kg、4mg/kg处理组MnCAT基因的相对表达量显著高于对照组和其他处理组（P<0.05）。

综合以上结果，以室内饲养5日龄幼虫MnSOD活性做拟合曲线，得到室内饲养蜜蜂幼虫人工饲粮中锰的适宜添加水平为2.96mg/kg。

4 讨论

4.1 蜜蜂饲粮中补充Mn可促进蜜蜂生长发育

图3 不同锰添加水平的糖浆饲料对各日龄成年工蜂MnSOD酶活性的影响

图4 不同锰添加水平的糖浆饲料对各日龄成年工蜂MnCAT酶活性的影响

图5 不同锰添加水平的糖浆饲料对各日龄成年工蜂T-AOC活性的影响

图6 不同锰添加水平的糖浆饲料对各日龄成年工蜂体内MnSOD基因表达量的影响

图7 不同锰添加水平的糖浆饲料对各日龄成年工蜂体内MnCAT基因表达量的影响

在蜜蜂饲粮中补充适量的Mn会促进蜜蜂的生长发育。对其他动物的研究发现，团头鲂获得最大增重率和特定生长率的饲料锰含量为12.9mg/kg，在饲料中添加适量的锰能促进团头鲂的生长，当饲料中锰含量大于23.16mg/kg时，会造成团头鲂生长受阻[8]。本试验结果基本与上述研究结果类似，意大利蜜蜂幼虫获得最大化蛹率和羽化率的饲料锰含量为4mg/kg。证明饲粮中添加适量的锰能促进意大利蜜蜂幼虫的生长，提高蜜蜂幼虫的存活能力和抵抗外界不良应激的能力。当锰含量由2mg/kg上升至4mg/kg时，化蛹率和羽化率都持续升高。所以，当人工饲养蜜蜂幼虫时，可以考虑适当添加锰，促进蜜蜂幼虫生长发育。

4.2 蜜蜂饲粮中补充Mn可提高蜜蜂的抗氧化能力

SOD活性的高低反映机体清除O2—的能力，即SOD活性越高，机体清除O2—的能力越强。迄今为止，已发现SOD有3种。其中MnSOD的主要功能是将细胞代谢产生的O2—歧化成H2O2，从而维持线粒体等亚细胞器膜的完整性和正常功能[9]。研究发现，动物饲粮中锰的添加水平直接影响MnSOD活性[10]。

在饲料中锰含量对方格星虫稚虫抗氧化酶活性的影响研究中发现，饲料中锰含量对方格星虫稚虫体腔液中MnSOD活性有显著影响，当饲料中锰的添加水平为28.67mg/kg时，方格星虫稚虫体内的MnSOD活性最高，但添加浓度过高时，方格星虫稚虫体内的MnSOD活性就会减弱[11]。本研究与上述研究结果相似，饲料中补充锰元素对意大利蜜蜂幼虫体中MnSOD活性有显著影响。随着饲粮中锰添加水平的升高，幼虫体内的MnSOD活性显著升高（P<0.05）。锰添加水平为3mg/kg时，幼虫体内的MnSOD活性达到最高，7日龄幼虫体中的MnSOD活性随着饲料中锰含量的升高出现上升趋势。分析其原因可能是，意大利蜜蜂幼虫从对照组饲粮中吸收较少，锰的减少会使MnSOD结构不稳定，Mn作为MnSOD的活性中心的作用减弱，降低MnSOD的活性。当蜜蜂幼虫摄入适量的锰时，会加强蜜蜂幼虫体内脂质过氧化作用，这一代谢的产物丙二醛（MDA）含量升高，机体的内自稳机制使蜜蜂幼虫体内抗氧化作用代偿性加强，蜜蜂幼虫体内MnSOD活性增高，且锰充分发挥作为MnSOD的活性中心作用。而7日龄幼虫对锰的需求量大于3、5日龄，因此随本实验人工饲粮所添加的锰浓度梯度升高，MnSOD的活性会持续增高。

生物体内存在的过氧化氢酶，CAT可分解蜜蜂体内歧化反应所积存的过氧化氢（2H2O2→O2+2H2O），减少体内H2O2与O2反应所生成的有害物质。目前已知的过氧化氢酶有两类：一类含血红素基（heme）；另一类不含血红素基（nonheme），但含有锰，称为锰过氧化氢酶（MnCat）[12]。人工饲料育蚕比桑叶育蚕的CAT活力高2%~10%，说明不同饲料对CAT有一定的影响[13]。本研究结果表明，饲料中锰含量对蜜蜂幼虫体中MnCAT活性有显著影响，随着饲粮中锰添加水平的升高，幼虫体内的MnCAT活性显著升高（P<0.05）。7日龄幼虫体中的MnCAT活性随着饲料中锰含量的升高呈现上升趋势，可能是意大利蜜蜂从饲料中吸收微量的锰，锰的减少使得MnCAT结构不稳定，Mn作为MnCAT活性中心的作用不能发挥，造成MnCAT的活性下降。随着人工饲粮中锰含量的增加，蜜蜂幼虫机体的内自稳机制会使蜜蜂体内抗氧化作用出现代偿性强化，体内MnCAT活性代偿性增高，产生高浓度的H2O2，因此MnCAT活性增高。在7日龄时，幼虫对锰的需要量大于3、5日龄，所以MnCAT活性随着饲料中锰含量的升高而呈现上升趋势。

图8 5日龄幼虫Mn-SOD活性拟合曲线

总抗氧化能力（T-AOC）反映蜜蜂的总抗氧化系统功能，可清除蜜蜂体内自由基，减少氧化损伤。锰元素主要以离子状态作为酶活化因子或组成部分在昆虫体内抗氧化机制中发挥其作用[14]。实验结果表明，饲粮中锰添加浓度的变化能够影响蜜蜂幼虫总抗氧化能力的变化，随着饲粮中锰添加水平的升高，幼虫体内的T-AOC活性显著升高（P<0.05）。当添加量在3mg/kg时，幼虫抗氧化能力达到最高，当高于3mg/kg添加量时抗氧化能力较低，可能是因为过量的锰会与其他矿物质发生拮抗作用，影响蜜蜂对其他矿物质的吸收，将会造成蜜蜂幼虫内环境紊乱，也会使一些酶活性降低。

4.3 Mn影响蜜蜂锰相关基因表达

酶相关基因的表达量和翻译后的剪切修饰影响酶活性的高低，锰能通过调节锰依赖性酶来调节DNA和RNA的合成与分解影响基因的表达量和翻译后的剪切修饰[15]，从而影响该酶的活性。MnSOD活性与MnSOD基因相对表达量密切相关，意大利蜜蜂幼虫MnSOD活性与蜜蜂MnSOD基因相对表达量受到饲粮中锰水平的影响，较高的酶基因表达量与较高的酶活性有正相关关系，3、5日龄幼虫4mg/kg处理组MnSOD酶活性显著高于对照组和其他试验组，且MnSOD基因的相对表达量也显著高于对照组和其他组。这可能是因为适宜的锰含量使MnSOD表达量较高，造成MnSOD酶活性增高，最终表现出其基因表达量与酶活性一致的效果。锰对于蜜蜂MnSOD酶基因表达量的影响与锰对MnSOD酶活性的影响有一致的作用。同样，饲粮中适宜的锰含量也会使意大利蜜蜂MnCAT基因相对表达量升高。3、5日龄幼虫4mg/kg处理组MnCAT酶活性显著高于对照组和其他试验组，MnCAT基因的相对表达量也显著高于对照组和其他试验组，可能是因为适宜的锰含量使MnCAT基因表达量较高，造成MnSOD酶活性增高。

5 结论

本研究首次探明了锰对幼虫生长发育和生理机能的影响，对室内饲养蜜蜂幼虫人工饲粮中适宜锰的添加水平进行了研究。锰对蜜蜂生长发育有促进作用。在意大利蜜蜂幼虫饲料中补充适量的锰时，且锰的添加水平大约在2.96mg/kg时，能够提高幼虫的抗氧化能力。