张世洋,王 晶 ,盛永成 ,李生茂 ,潘 媛 ,*,敖 慧,*
(1. 成都中医药大学,四川 成都 610075;2. 川北医学院,四川 南充 637000)
白芷是中医临床的常用药,为伞形科植物白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav.]或杭白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav.var.dahurica cv.Hangbaizhi Yuan et Shan]的干燥根,具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效[1]。白芷药材按照历史产区主要分为4类,分别为杭白芷、川白芷、禹白芷及祁白芷。目前大多数学者认为伞形科植物白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav.]为药材禹白芷和祁白芷的原植物,杭白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav.var.dahurica cv.Hangbaizhi Yuan et Shan]为川白芷和杭白芷的原植物。白芷为中医常用药,加上其适应能力强,近代许多地方对白芷进行引种栽培,形成了新的白芷产区,如安徽亳州、山东菏泽等。基原、环境、气候、栽培方式、加工方式等不同,可使不同产地的白芷品质产生差异,因此对不同产地的白芷物质基础进行研究具有深远意义。白芷已被证明具有镇痛、抗炎、抗病原微生物、抗肿瘤以及中枢兴奋作用等作用[2-7],除药用之外,白芷在香料、食品、日用化工等方面都有广泛的运用。当前对白芷挥发油的化学成分研究主要集中在对1~2产地品种的研究[8-10],对多产地白芷挥发油的研究尚未见报道。本文选取了分别来源于四川、浙江、河北、河南、安徽、山东的白芷即川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳州白芷、山东白芷为研究对象,用水蒸气蒸馏法提取6种不同产地的白芷挥发油,并用气质联用技术首次对6种不同产地的白芷挥发油进行比较分析,旨在进一步明确白芷物质基础及其影响因素,以促进白芷药材的质量提升和进一步开发利用。
1.1.1 材料与试剂
药材来源:白芷均购自成都国际商贸城,经成都中医药大学药学院生药系陈璐副教授鉴定购买的川白芷、杭白芷为植物杭白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav.var.dahurica cv.Hangbaizhi Yuan et Shan]的干燥根,购买的祁白芷、禹白芷、亳州白芷、山东白芷为伞形科植物白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav.]的干燥根。
正己烷(成都市科龙化工试剂厂产品,批号:2015111701);无水硫酸钠(成都市科龙化工试剂厂产品,批号:2015051801);水为蒸馏水。
1.1.2 仪器与设备
挥发油提取器,ZDHW-20000型电热套,HX-200型高速中药粉碎机,Agilent7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪,Agilent GC-MSD工作站,Sartorius BP211D AG电子天平。
1.2.1 挥发油的提取
水蒸气蒸馏法提取:分别将药材粉碎成干粉,过4号筛,称量500 g药材干粉,装入10 000 mL水蒸气蒸馏提取器中,加入10倍蒸馏水,用电热套加热至微沸,提取8 h,收集蒸馏液,加入适当无水硫酸钠除去下部蒸馏水即得油状提取物,密封后放置于4℃冰箱保存。提取率计算公式为:
取上述挥发油10 μL溶于1 mL正己烷,加入适当无水硫酸钠除水后用微孔滤膜过滤,装入进样瓶,为气相色谱-质谱(GC-MS)测定样品。
1.2.2 白芷挥发油成分分析
GC-MS工作条件:色谱柱型号HP-5MS毛细管质谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm);载气为氦气,体积流量1.0℃/min;采取程序升温,初始温度60℃,以10℃/min升至170℃保持3 min,以5℃/min升至290℃保持3 min;分流进样,分流比20∶1;进样量1 μL;扫描模式:全扫描;电离方式 EI,电子能量70 eV,离子源温度230℃。
定量定性方法:各色谱峰对应的质谱图经联用仪的计算机谱库检索进行定性,质谱数据为NIST14谱库。各组分的相对含量是根据总离子流图由计算机采用峰面积归一法计算获得。
1.2.3 聚类分析
将样本化学成分导入SPSS13.0软件,采用Complete linkage法进行聚类,利用平方欧式距离作为样品的测定。
1.2.4 数据处理
采用安捷伦工作站进行挥发油成分分析,SPSS软件和Excel软件进行数据统计分析。
川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳州白芷和山东白芷分别获得 0.25、0.10、0.15、0.10、0.15、0.14 mL油状液体,有刺激性。提取率分别为0.05%、0.02%、0.03%、0.02%、0.03%、0.028%。
挥发油经GC-MS分离分析的总离子流图如图1所示,通过NIST14质谱数据系统检索和人工解析,并采用峰面积归一化法测定各组分相对百分含量,将各化合物积分面积列表,共计111种化合物,结果见表1。
图1 白芷挥发油总离子流程图Fig.1 The total ionic flow diagram of Baizhi from six different habitats
表1 6种产地白芷挥发油成分分析Table 1 Analysis of volatile oil composition of Baizhi from six different habitats
续表1 6种产地白芷挥发油成分分析Continue table 1 Analysis of volatile oil composition of Baizhi from six different habitats
续表1 6种产地白芷挥发油成分分析Continue table 1 Analysis of volatile oil composition of Baizhi from six different habitats
续表1 6种产地白芷挥发油成分分析Continue table 1 Analysis of volatile oil composition of Baizhi from six different habitats
由表1可见,通过GC-MS共鉴定出111个挥发油成分,其中川白芷57个,杭白芷51个,亳州白芷45个,祁白芷30个,山东白芷32个,禹白芷39个,分别占各自挥发油总量的91.15%、88.28%、92.78%、93.38%、94.65%、92.32%。共有成分11个,分别占川白芷的65.69%,杭白芷的57.72%,亳州白芷的63.56%,祁白芷的75.68%,山东白芷的74.05%,禹白芷的68.89%,在白芷挥发油中含量最高的为醇类化合物和烯类化合物,醇类化合物分别占川白芷的55.11%、杭白芷的42.84%、亳州白芷的53.58%、祁白芷的68.37%、山东白芷的63.22%、禹白芷的57.68%。烯类化合物分别占川白芷的20.98%、杭白芷的21.15%、亳州白芷的23.04%、祁白芷的12.04%、山东白芷的10.52%、禹白芷的16.11%。6种产地的白芷挥发油中含量最高的物质均为十二醇与十四醇,杭白芷的十二醇与十四醇含量均低于其它5种产地的白芷。祁白芷、山东白芷和禹白芷的烯类化合物、酮类化合物、醛类化合物以及烷烃类化合物含量均低于其余3种产地的白芷。
六种不同产区白芷药材挥发性化学成分聚类分析结果如图2所示,结果显示,杭白芷单独聚为一类,其余5种聚为一类,这5种当中川白芷与亳州白芷聚为一类,祁白芷、禹白芷、山东白芷聚为一类。
图2 6种产地白芷挥发油化学成分聚类结果Fig.2 Clustering results of the constituents of essential oil of Baizhi from six different regions
通过GC-MS鉴定出6种不同产地白芷挥发油成分当中含量最高的种类为醇类,其中含量最高的化合物为十二醇,与李玲等[11]、杨祖金等[12]的报道一致。但其与挥发油成分镇痛、镇静、抗炎、抗过敏等作用有无关系尚未见报道,值得进一步研究。马逾英等[10]报道亳州白芷挥发油主要成分为9-十六碳烯酸十四烷酯(11.40%)、2-氯乙基亚油(10.69%)、9,12-十八二烯酸乙酯(7.28%)。张强等[13]报道杭白芷挥发油中含量最高的为壬基环丙烷(44.8%)、α-蒎烯(14.1%)、十四醇(5.1%),造成这些差异的原因可能与药材的产地、基原、加工方式、提取方式以及检索谱库的不同有关。
化学成分聚类分析结果显示,杭白芷与其他白芷挥发油组成区别较大,如其十二醇、十四醇含量明显低于其他白芷,因此单独为一类。川白芷与杭白芷在历史上出现过互相引种的情况,遂宁县志[14]记载“明朝时期遂宁出了四大家族,……从浙江带回种籽,种植逐年扩大”,表明川白芷最初引种自浙江,袁昌齐[15]的研究则表明历史上杭州的白芷出现断档,又从四川引种进行栽培。由此可见,川白芷和杭白芷在历史上存在种子互用的事实,其原植物相同。郭丁丁[16]依据基因遗传相似度,将栽培白芷中的杭白芷与其它白芷分开,单独聚为一类。本研究聚类分析结果将杭白芷单独聚为一类,说明其与其他产地白芷(特别是同基原川白芷)挥发油成分不同。此外,杭白芷的挥发油提取率也远低于其他地方白芷。既往产地调研表明,杭州历史上的杭白芷主产地已有30多年未栽种白芷,其杭白芷的产区发生了转移,且栽种面积小,一般自产自销[17-18]。杭州除使用本地的白芷外,还从四川、安徽引进白芷使用。杭白芷原产地的种植减少以及产地的转移,会导致白芷种质资源质量改变,而异地引种的操作会导致种质混杂。杭白芷种质资源可能存在一定退化现象。这或许是杭白芷挥发油化学成分与其他白芷区别较大的原因。此外,本研究表明,引种自祁白芷的亳州白芷与祁白芷挥发油组成差别较大,与川白芷更为接近。可能与四川和安徽同处长江以南,生产加工方式、气候条件、栽培条件较为类似有关。王娜等[19]研究表明,不同产地的白芷移栽到四川遂宁白芷种质资源圃中,经过一个生产周期后除兴安白芷性征差异大外,其余各地白芷外观上无明显的区别,且香豆素含量都比之前升高,说明地域、种植、加工方式会对白芷化学成分产生影响。而同一基原,同样出自北方的祁白芷、山东白芷、禹白芷挥发油化学成分较为类似,说明基原和(或)产地对白芷的挥发油成分有一定影响。因此,白芷的挥发油成分可能受产地、基原、气候、栽培、加工、种质资源质量等多方面的影响。但有学者综合分子遗传学的分析和形态、解剖、化学等结果,提出现有4大商品白芷应属于同一种[20]。结合本研究结果,笔者认为基原对化学成分的影响可能并不大。而产地、气候、栽培、加工、种质资源质量等对白芷挥发油成分有一定影响。
上述试验结果表明,醇类化合物(十二醇、十四醇为主)是川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳州白芷、山东白芷等六种不同产地的白芷挥发油主要成分。各地白芷挥发油组成有一定区别。相比于基原因素,白芷挥发油组成与产地、气候、栽培、加工、种质资源质量等因素关系可能更为密切。