球孢白僵菌Beauveria bassiana对茶蚜Toxoptera aurantii致病力筛选及毒力活性研究

秦丽 ， 卫书霞 ， 汪仁敏 ， 姜浩 ， 朱虹 *

（1.安徽省微生物防治重点实验室，安徽合肥 230036；2.安徽农业大学大学林学与园林学院，安徽合肥 230036；3.赤壁市农业农村局，湖北赤壁 437300；4.茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽合肥 230036）

茶蚜Toxoptera aurantii（Boyer de Fonscolombe，1841），又称茶二叉蚜，俗称蜜虫、腻虫，属半翅目Hemiptera、蚜科Aphididae，是茶园中的一种重要害虫[1-2]，我国的主要产茶区均有分布，国外主要分布于美洲、非洲、东亚、澳大利亚、印度和地中海等地区[3-4]。茶蚜繁殖快，危害严重，各茶区每年均有不同程度的发生[4]。它不仅通过直接刺吸幼嫩芽梢产生危害，其排泄物污染嫩梢，诱发煤烟病发生，造成茶叶的产量和品质严重下降，导致严重的经济损失[5-6]。目前对于蚜虫的防治多采用化学防治，然而长期滥用化学农药对环境和高等生物产生巨大伤害[7]，易造成茶叶“农残”超标、环境污染和茶园生态平衡失调，危及饮茶者的身体健康[8]，这与人们对高品质名优茶的需求及当前推行的绿色茶叶生产相矛盾。因此，茶树害虫的绿色防控方法和策略日渐迫切，必须寻求新的途径，积极挖掘切实可行的生物防治技术。目前利用昆虫病原真菌（Entomopathogenic fungus）控制害虫种群数量以减少杀虫剂使用，成为害虫综合治理中一种安全、高效的防治方式。利用昆虫病原真菌开发的生物农药具有易分解、低残留、目标性强、不易产生抗性等优点，符合高效、安全的茶园害虫绿色防控策略，对茶叶产量、品质的提高和茶产业经济效应的提升具有重要的战略意义和应用价值。

球 孢 白 僵 菌Beauveria bassiana[（Balsamo）Vuillemin， 1912]，是子囊菌门（Ascomycota），虫草科（Cordycipitaceae），白僵菌属（Beauveria）的一类广谱性昆虫病原真菌[9-11]，可寄生约15个目149个科的700多种昆虫[9，12]。研究表明，球孢白僵菌主要通过分生孢子、芽生孢子和菌丝体三种侵染体侵入健康昆虫体内、迅速增殖并导致昆虫死亡，分生孢子是最自然有效的侵染体[13]，其萌发速度决定菌株对害虫的致病力[14]。球孢白僵菌分生孢子侵染害虫的主要途径有体表侵入、消化道侵入和气孔侵入，其中以体表侵入为主[13，15]。孢子侵入和增殖过程中，还会分泌一些有毒物质（如白僵菌素、白僵菌交酯、球孢交酯等毒素）加快寄主昆虫的死亡[16]。寄主昆虫被白僵菌侵染后通常表现为取食减少，反应迟钝，并出现僵直症状，随着寄主体内菌丝大量生长，迅速耗尽寄主的营养，导致寄主因代谢紊乱或代谢障碍而死亡[13]，并最终出现虫体被白色菌丝和分生孢子覆盖的现象。

目前国际上已有约60余种以球孢白僵菌为原药成分的杀虫剂登记注册，占比真菌杀虫剂品类总数的三分之一以上[17]，但是利用球孢白僵菌防治茶蚜的研究相对鲜见。研究评价了供试的9株球孢白僵菌对茶蚜的致病力，筛选出3株对茶蚜具有较高致病力的菌株；通过计量效应活性模型，筛选并明确了高致病力活性菌株Bb2032；进一步通过LC50活性评价了高致病力菌株Bb2032对茶蚜的毒力活性。该研究将为利用球孢白僵菌防治茶蚜提供了理论依据和应用基础，为茶树有害生物综合治理和高品质茶叶生产提供技术支撑，对我国茶产业健康可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与菌株

1.1.1 茶蚜的饲养

供试茶蚜采自安徽农业大学高新技术农业园茶园，室内饲养于安徽农业大学生物工程中心养虫室，室内温度25±1℃，相对湿度70%～80%。采集的蚜虫饲养于养虫笼内，剪取带有新生嫩梢的茶枝，每笼2～3根茶枝，用塑料容器盛水并花泥固定，集中饲养约5～6代后，挑选健康的无翅茶蚜用于生物测定。

1.1.2 供试球孢白僵菌菌株

选取安徽农业大学微生物防治重点实验室虫生真菌研究中心提供的9种分离自蚜虫及半翅目昆虫上的球孢白僵菌菌株，菌种基本信息见表1。

表1 球孢白僵菌菌株寄主及来源Table1 Insect hosts and geographic origins of tested B.bassiana strain

1.2 仪器与设备

生物测定试验所使用的主要仪器设备：Potter喷雾塔（Burkard Manufacturing，Co.， Ltd.），光学显微镜（BX51、SZX10，Olympus Corporation），超净工作台 （SW-CJ-1FD，江苏通净净化设备有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG9101-2SA，上海三发科学仪器有限公司），漩涡磁力振荡器（MS3，德国IKA公司），电子天平（AUY220，日本岛津公司），立式高压蒸汽灭菌锅 （HVE-50，日本Hirayama公司），光照培养箱（MGC-250，上海一恒科学仪器有限公司），恒温震荡培养箱（ZQZY-C，上海凌仪实业有限公司）等。茶蚜饲养所需工具：养虫笼（35 cm×35 cm×35 cm，杭州艾普仪器设备有限公司），饲养瓶（8.6 cm×9.5 cm×7.5 cm，泰州市苏东教学设备有限公司），花泥（23 cm×11 cm×7 cm，义乌市瑞趣工艺品有限公司），加湿器（HQ-JS130H，中山市浩奇电器有限公司），软毫勾线笔（0号，上海亿美科技有限公司），塑料盆（38 cm×24 cm×10 cm，济南德嘉仓储设备有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 球孢白僵菌孢子悬液的制备

表1所选的9株杀虫菌株接种在SDAY培养基上，人工智能光照培养箱（温度25±1℃，光周期14 L∶10 D）培养10 d。待充分产孢后，将孢子转移至灭菌冷却的0.05%的TW-80溶液中，在漩涡磁力振荡器上（150 r/min）震荡15 min，使孢子均匀分散，利用灭过菌的塞脱脂棉针管过滤得到孢子悬液，在显微镜下使用血细胞计数板统计孢子数量并计算孢子悬液浓度。根据试验需要使用0.05%TW-80溶液按比例稀释得到不同浓度梯度的孢悬液。

1.3.2 高致病力菌株的筛选

试验采用Potter喷雾法对9株供试菌株进行活性筛选。使用湿润的细毛笔将饲养的健壮无翅成蚜接到无菌培养皿上，用Potter喷雾塔分别均匀喷雾2 mL浓度为1×107孢子/mL球孢白僵菌的分生孢子悬浮液。喷施完毕后将无翅茶蚜转移到滤纸上待虫体自然晾干。将茶蚜转移到无菌饲养盒中（放置了茶鲜嫩叶），放入25±1℃，相对湿度70%的人工智能气候箱中培养观察。茶鲜嫩叶每2 d更换一次，每隔24 h清除茶梢上的新生若蚜并观察成蚜的发病情况，以虫体僵直，毛笔轻触虫体无反射行为判定为死亡，连续记录7 d时间。每个处理设置3个重复，每个重复试虫30只，以无菌水为对照组。镜检有菌丝覆盖的虫体确认为球孢白僵菌感染死亡，并统计各组球孢白僵菌处理后的死亡数和僵虫数。

1.3.3 不同浓度球孢白僵菌对无翅茶蚜的侵染力

根据“1.3.2”中对各菌株的毒力评价结果，选出3株综合致病力较强的菌株开展进一步筛选。分别配制 1×106、1×107、1×108孢子/mL 三个浓度梯度球孢白僵菌孢悬液对茶蚜进行致病力测定，每个处理设3个重复，每个重复使用试虫30只，以无菌水为对照，接菌、侵染、统计方法按照“1.3.2”进行。统计各组球孢白僵菌处理后的死亡数和僵虫数，计算死亡率、感染率、LT50，综合评价筛选出致病力最好的菌株。

1.3.4 高致病力球孢白僵菌株对无翅茶蚜的毒力活性

将筛选出的最高致病力菌株配制 1×106、5×106、1×107、5×107、1×108孢子/mL 的五个浓度梯度的孢子悬浮液，使用Potter喷雾塔处理无翅茶蚜，每个处理设置3个重复，每个重复使用试虫30只，以无菌水为对照，侵染、饲养、统计方法按照“1.3.2”的操作进行。

1.4 数据处理

利用SPSS Statistics 23数据处理软件计算侵染后无翅茶蚜的死亡率和感染率，并进行统计分析，采用单因素方差分析 （One-way ANOVA）和Probit回归计算球孢白僵菌菌株对无翅茶蚜致病的 LC50和LT50。

相关计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌菌株对无翅茶蚜致病力活性

9株球孢白僵菌分生孢子液对无翅茶蚜的致死效果如表2所示。采用2 mL球孢白僵菌菌液浓度1×107孢子/mL接种茶蚜第7 d的校正死亡率在53%以上，其中Bb2032、Bb2488和Bb444这3株球孢白僵菌菌株对无翅茶蚜的致病力较高，校正死亡率分别为96.29%、92.70%和90.72%，僵虫率在84%～95%之间，表明该3株菌株的死亡率显著高于其他菌株，且该3株菌株对无翅蚜的致病力强弱为Bb2032＞Bb2488＞Bb444。死亡率和感染率最高的是菌株Bb2032，致死中时 也最短，仅为3.822 d。 Bb108、Bb2724、Bb107、Bb725 这 4 株供试菌株致病力次之，校正死亡率在69%～83%之间，LT50在4.7～5.0d之间，差异较小。而菌株Bb83和Bb3009致病力最弱，7 d校正死亡率未到60%，分别为59.83%和53.69%，LT50均在5 d以上，其中Bb3009僵虫率仅为46.97%。因此，根据试验结果选择 Bb2032、Bb2488、Bb444这 3株菌株开展进一步研究。

表2 9株球孢白僵菌菌株对茶蚜的致死效果（7 d）Table 2 Lethal effects of different B.bassiana strains on T.aurantii（7 d ）

2.2 筛选的3株球孢白僵菌不同浓度下对茶蚜的致病力

将筛选获得致病力较好的3株球孢白僵菌株Bb2032、Bb2488、Bb444 分别配制 1×106、1×107、1×108孢子/mL三个浓度梯度的孢子悬浮液，进一步对无翅茶蚜的室内致病力测定，分别统计接菌后8 d内供试的3株菌株对供试茶蚜的累计死亡率，其结果见图1。供试的3株菌株在接种茶蚜前6 d内，均呈现出一定的剂量效应，即3株菌株均随着接种菌浓度的增加，茶蚜的死亡率逐渐升高；第7 d和8 d，随着虫体上致病菌孢子量的积累，杀虫活性趋于稳定，没有相应的剂量效应关系。

接菌浓度在1×106孢子/mL，接菌3 d内各处理间差异不明显，第4 d处理组开始出现死亡率的快速增长，其中菌株Bb2032累计死亡率显著高于其它两菌株，并在第6 d各处理组达到死亡率高峰（图 1-A）。在菌液浓度为 1×107和 1×108浓度下，分别接3种菌株2 d后，茶蚜开始出现死亡现象，但死亡率相对较低，3 d以后接种所有菌株的茶蚜均进入死亡快速增长时期，并且菌株Bb2032明显优于菌株Bb444和Bb2488（图 1-B和C），其中在1×108浓度下，接种4 d菌株Bb2032对茶蚜的死亡率高达75%以上（图1-C）。菌株Bb444和Bb2488在相对较高的两个浓度下，接种5 d左右进入死亡高峰期，死亡率均高于60%（图1-B和C）。研究结果表明，3株菌株均表现出浓度剂量效应关系，在菌液浓度为1×108孢子/mL下所有处理第4 d出现死亡高峰，其中菌株Bb2032和Bb2488在第8 d累计死亡率可达100%。综合各处理致病力分析，3株球孢白僵菌对茶蚜致病力Bb2032最高，Bb2488和Bb444菌株相对次之。

图1 不同球孢白僵菌对茶蚜的累计死亡率Fig.1 Dynamics of the cumulative mortality rate of T.aurantii treated by various B.bassiana

2.3 高致病力球孢白僵菌菌株Bb2032对茶蚜致病力

将菌株 Bb2032 配置成 1×106、5×106、1×107、5×107、1×108孢子/mL 五个浓度梯度的孢子悬液。将配置的5个浓度孢子悬液分别对茶蚜做接菌处理，并统计8 d累计死亡率，其结果见图2。

图2 球孢白僵菌Bb2032不同浓度孢悬液对茶蚜的侵染累计死亡率动态Fig.2 The cumulative mortality dynamics with different concentrations of strain Bb2032 on T.aurantii

由图2可知，在接菌2 d内，球孢白僵菌Bb2032菌株不同浓度处理的茶蚜死亡率没有显著性差异，说明球孢白僵菌侵入虫体并致病需要一定的时间，这也符合昆虫病原真菌致死速度慢的特点。在接菌3 d后，球孢白僵菌对茶蚜的死亡率显著增加，并呈现出明显的时间-效应关系。即随着接菌处理时间的延长，茶蚜的死亡率显著增加，所有浓度在接种后的4～5 d进入死亡高峰期，并均在6 d左右达到峰值，随后缓慢增加。此外接菌3 d后，球孢白僵菌对茶蚜的死亡率还呈现出明显的浓度-效应关系。即在相同的处理时间点，随着浓度的增加，茶蚜的死亡率显著增加，其中接种 4 d， 浓度为 5×107、1×108孢子/mL 的蚜虫死亡率均高于60%，接种5 d死亡率高达90%左右。

表3 球孢白僵菌Bb2032不同浓度处理茶蚜的LC50Table 3 LC50on different concentration of the strain Bb2032 to T.aurantii

分别选取球孢白僵菌对茶蚜的死亡率进入快速增长期第4 d，和进入最终稳定期第8 d这个两个关键时期，计算其累计校正死亡率和致死中浓度LC50值，结果见表3。由表3可知，分别在第4 d、8 d校正死亡率均呈现出计量-效应关系，且线性关系很好（r＞0.98）。同时随着处理天数增加，也呈现出明显的时间-效应关系，即在相同浓度下8 d的茶蚜的死亡率均显著高于4 d的死亡率。第4 d和8 d成虫致死中浓度分别为2.881×107孢子/mL和2.102×104孢子/mL。表明球孢白僵菌防治茶蚜，在一定的时期内，随着处理时间的延长，其防治效果逐渐增加。

2.4 高致病力菌株Bb2032对茶蚜的侵染症状

正常无翅茶蚜体长约2 mm，近卵圆形，腹部肥大，有光泽的黑色、棕褐色，体表多细密横列网纹（图3-A）。茶蚜感染初期无明显的行为改变，2 d之后行动开始迟缓，不喜动，易从叶片或茶梗上掉落，掉落的茶蚜几乎保持静止，毛笔触碰有反应。第3 d开始部分茶蚜虫体上有菌丝长出，但未死亡，菌丝主要出现在蚜虫腹管和头部两个位置（图3-B）。接菌3～5 d后会有大量死亡，绝大部分试虫死后直接从叶片或茶梗上脱落，少数仍停留在取食处，稍有黏附。死亡后的虫体干瘪，在湿润的滤纸上继续培养，1 d内会长出大量肉眼可见的白色菌丝，菌丝由腹管、头部向背部蔓延（图3-C），死亡4 d内虫体会被菌丝彻底覆盖（图3-D）。

图3 茶蚜感染球孢白僵菌的症状Fig.3 The infection symptom of T.aurantii by B.bassiana

3 讨论

球孢白僵菌作为一种广谱的昆虫病原菌，已被广泛的用于防治各种农林害虫[18]。我国自20世纪70年代大规模应用白僵菌防治林业害虫马尾松毛虫并取得成功，成为了世界上生产和使用白僵菌最多的国家[19]。利用昆虫病原真菌安全高效的防治害虫在绿色防控中发挥着重要作用。球孢白僵菌作为一种重要的生防菌，其寄主范围广泛但不同菌株之间存在较明显的寄主专化性[20]。因此，利用球孢白僵菌开展害虫防治的实际应用中，首先要开展致病力的筛选研究，以确认菌株的防治效果。研究通过昆虫病原菌的室内毒力测定喷雾方法，开展供试的9株球孢白僵菌对茶蚜的致病力活性的筛选研究，初步获得3株茶蚜高致病力球孢白僵菌菌株Bb2032、Bb2488和Bb444。对初筛的3株优势菌株开展进一步的致病力活性研究，明确了高致病菌株Bb2032。进而对高致病菌株Bb2032开展了全面的室内致病力毒力评价，4 d和 8 d的 LC50分别为 2.881×107和 2.102×104孢子/mL。目前开展白僵菌对昆虫的毒力研究较多的集中在蚜虫、粉虱和一些鳞翅目的幼虫[21-23]，并取得了很好的防治效果。但是运用昆虫病原真菌防治茶蚜的研究较为鲜见，有相关利用蜡蚧轮枝菌开展对茶蚜的侵染性研究的报道[24]，研究表明V07菌株对茶蚜具有较好的侵染效率。研究筛选获得球孢白僵菌控对茶蚜表现出了较高的致病力和良好的致死效果，同时与蜡蚧轮枝菌相比，白僵菌的制剂加工和存储工艺相对更为成熟，因此，利用球孢白僵菌开展茶蚜的生物防治更具有良好的应用前景。研究将为运用球孢白僵菌生物防治茶蚜提供理论研究，为茶园有害生物的绿色防控提供新的技术和策略。