超高效液相色谱-串联质谱法 测定猪肉中肾上腺素残留量

双汇集团 河南漯河 462003

肾上腺素(Epinephrine)又叫酒石酸肾上腺素、副肾碱、副肾素、盐酸肾上腺素，分子式为C9H13O3N，分子量183.204，白色或黄白色结晶性粉末，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚，在日光下易氧化，是肾上腺分泌的一种非常重要的儿茶酚胺类物质[1]。它作为一种激素和神经传送体，临床主要用于心脏骤停、支气管哮喘、过敏性休克，是拯救濒死的人或动物的必备品。当用量过大或皮下注射误入静脉时，可引起血压骤升、心律失常，严重者可发展为脑溢血、心室颤动。若在养殖过程中非法使用，其残留对消费者的身体健康存在安全隐患。

目前，国内外报道的针对肾上腺素的检测方法有分光光度法[2]、高效液相色谱法[3～5]、离子色谱法[6]、毛细管电泳法[7]、放射免疫和酶免疫[8]等方法，但这些方法主要集中在人体血清、尿液、药物中的测定，猪肉中肾上腺素残留量的测定方法未见报道，因此建立一种简便、准确的肾上腺素残留量的检测方法十分必要。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱仪，通过优化样品前处理方法、液相色谱分离条件及质谱检测条件，建立了猪肉中肾上腺素残留量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱联用仪，Waters公司；

PL2002型电子天平，Mettler Toledo公司；

VX-III型多管漩涡混合振荡器，Targin公司；

MIKRO 200R型冷冻离心机，德国Hettich公司；

H-1850R型离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

食品加工机，Braun公司；

T18型高速匀浆机，德国IKA公司。

1.2 材料与试剂

肾上腺素标准品，Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈(质谱纯)，Fisher公司；

甲醇(色谱纯)，Merck公司；

甲酸(质谱纯)，Fisher公司；

甲酸铵(色谱纯)，Kermel公司；

其他试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

取适量猪肉样品绞碎，并使均质，制成均匀样品，-18℃以下保存。

1.3.2 标准储备液的配制

准确称取肾上腺素标准品10.0mg，用水配制成100μg/mL储备液(加入适量甲酸)，-18℃冰箱避光保存。

1.3.3 中间浓度标准溶液的配制

准确吸取一定量标准储备液(1.3.2)，用水稀释为1μg/mL，-18℃冰箱避光保存。

1.3.4 基质标准工作溶液的配制

准确吸取一定量中间浓度标准溶液(1.3.3)，用空白样品提取液配成5、10、20、50、100、200、500ng/mL的基质标准工作液，现用现配。

1.3.5 样品前处理

称取2.00g±0.01g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入200μL 0.1mol/LEDTA溶液和10mL乙腈+甲醇(95+5)提取液，涡旋混匀，振荡20min，5 000r/min离心5min，上清液转移至另一离心管中。向残渣中加入10mL乙腈+水(15+2)溶液重复提取，合并两次提取液，40℃下氮吹至干。用2mL2%甲酸乙腈+水(1+4)定容，加入10mL正己烷除脂，7 000r/min离心5min，吸取下层液于1.5mL离心管中，14 000r/min冷冻离心5min，过0.22um滤膜，供液相色谱-串联质谱联用仪测定。

1.3.6 UPLC-MS/MS分析

1.3.6.1 UPLC条件

色谱柱：Waters BEH-C18，2.1×50mm，粒径1.7μm。

柱温：40℃。

进样量：5μL。

流速：0.3mL/min。

流动相：A，0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵溶液；B，乙腈，洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.6.2 MS条件

离子源：电喷雾(ESI)，正离子模式。

扫描方式：正离子扫描。

检测方式：多反应监测(MRM)，电离电压3.0kv，源温150℃，雾化气温度450℃，雾化气流量900L/h，锥孔气流量30L/h，碰撞气为高纯氩气。

肾上腺素的定性、定量离子对，采集时间，碎裂电压、碰撞能量如表2所示。

表2 MRM模式下肾上腺素的监测条件

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

根据肾上腺素的化学性质和溶解性，实验比较了无水乙酸钠、氢氧化钠甲醇溶液、0.6%氨水乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈+水(8+2)溶液、乙腈+甲醇(95+5)溶液为提取液的提取效果以及不同净化柱(阴离子交换柱、MCX柱、PEP-2柱)的净化效果，结果发现采用乙腈+甲醇(95+5)为提取液，且不经过净化柱，同时配制基质标的提取效果和回收率最佳。

2.2 色谱条件的优化

肾上腺素的极性比较强，在多种色谱柱上保留效果差，实验比较了C18、C8、T3、HILIC和Amide色谱柱对色谱分离效果和响应值的影响，C18色谱柱测定时，肾上腺素响应值明显高于C8、T3、HILIC、Amide色谱柱；流动相种类比较了甲醇、乙腈作为有机相，发现肾上腺素在含甲醇的有机相中峰形较差；水相比较了添加不同体积分数的甲酸及甲酸铵、乙酸铵的影响，最终选择5mmol/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)为流动相A，乙腈为流动相B；同时考察了不同洗脱梯度对其保留时间和MS图效果的影响，结果显示，采用表1中的洗脱梯度时，峰形最好，检测灵敏度最高。

2.3 质谱条件的优化

根据肾上腺素的化学结构，它适合在ESI+模式下进行离子化，其母离子为[M+H]+。试验采用500ng/mL的肾上腺素标准溶液进样，采用全扫描和子离子扫描，同时通过自动扫描和手动扫描相结合，最终找到了母离子和子离子，并优化了锥孔电压和碰撞能量，得到了待测物灵敏度较高的质谱条件。利用优化后的色谱和质谱条件测定肾上腺素标准溶液，其多反应监测(MRM)色谱图见图1。

图1 肾上腺素的多反应监测(MRM)色谱图

2.4 线性回归方程与定量限

按1.3.4中配成系列浓度的标准工作溶液，按1.3.6中建立的仪器条件进行测定。以色谱峰面积(Y)和质量浓度(X)做线性回归，结果显示，肾上腺素在5～500ng/mL范围内，线性关系良好(r=0.9998)，见表3。通过阴性猪肉样品加标测定，以定量离子对的10倍信噪比为定量限，得到本方法的样品定量限为10μg/kg。

表3 肾上腺素的线性方程

2.5 回收率实验和精密度

在阴性猪肉样品中进行加标回收率测定，按表4进行实验。结果表明，肾上腺素在猪肉样品中的加标回收率为75%～98%，RSD为4.8%～7.9%，能够满足检测方法的要求。

表4 肾上腺素的回收率和精密度

2.6 实际样品测定

采用建立的肾上腺素分析方法对20个猪肉样品进行检测，结果均为阴性。

3 结论

本实验分别对样品的前处理方法、色谱和质谱条件进行优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定肾上腺素残留量的方法。该方法简便、快捷、准确、回收率高，适用于猪肉中肾上腺素的定量分析和确证，在实际检测工作中具有很好的应用价值。