补肾填精方对Lewis肺癌细胞增值及凋亡的影响*

华杭菊 张丽枫 任丽萍 卢丽莎 郑 艳 陈武进

肺癌是常见恶性肿瘤之一，近年来，因气候环境变化及饮食习惯的改变，其发病率及死亡率逐年上升，根据2017年国家癌症中心的数据显示，肺癌是目前致死原因第一的恶性肿瘤，是男性常见肿瘤发病率第一位[1]。虽然目前肿瘤治疗手段越来越丰富，但其整体预后仍然很差，5年生存率不足20%[2]。而中药复方因其多靶点、多途径特点，大量研究显示，复方中药特别是补益类可改善机体免疫功能，提高生存质量等而广泛应用于临床。基于“肾生骨髓”“肾虚致瘤”及现代医学认为骨髓是免疫活动细胞的主要源泉，故中医学肾本质与免疫有着密切的关系。因此，进一步探究补肾填精方中药复方对 Lewis 肺癌及其T细胞增殖能力影响，探讨补肾填精方改善肺癌细胞肿瘤免疫微环境，抑制细胞增值和诱导细胞凋亡提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和 Lewis 肺癌细胞株SD大鼠20只，鼠龄6～8周，雄性，体质量(20±2)g；动物级别SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号: SCXK(沪)2017-0003。饲养于福建中医药大学实验室动物房；室温25℃，湿度70%，国家标准固体混合饲料喂养，小鼠自由采食和饮水。小鼠Lewis肺癌细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，RPMI1640培养液(含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 U/ml的链霉素、pH=7.2)培养，培养箱保持条件为：37℃、5%CO2及饱和湿度。每隔1天进行培养基换液，每3 d传代1次。

1.1.2 主要试剂及仪器补肾填精方(枸杞子、制何首乌和淫羊藿)按照药物计算剂量: 枸杞子30 g,制何首乌30 g和淫羊藿30 g。福建中医药大学附属人民医院中药房购买，浸泡2 h后，煎煮1 h，二煎8倍量蒸馏水，煎煮1 h，合并煎液，过滤，浓缩，超速离心后，继续浓缩，离心喷雾干燥器制粒。用蒸馏水溶解稀释至所需浓度。DMEM 购自Hyclone公司，胰蛋白酶、青霉素-链霉素、胎牛血清购自美国Gibco公司，CO2细胞培养箱香港力康仪器设备有限公司，CKX41 倒置显微镜为日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备SD大鼠共20只，随机分为补肾方中药低、中、高剂量组以及NS对照组4组。分别为15.75、31.50、63.00 g·kg-1(即按照70 kg体质量的成人临床用量的1倍、2倍、4倍)(并根据不同种属间剂量等效折算表换算)，水煎煮后，将药物浓缩至含生药0.79、1.58、3.16 g·ml药液大鼠灌胃给药，每次2 ml灌胃，每日2次给药；对照组给予0.9%NS，每日2次,每次2 ml。4组均连续灌胃给药5 d，末次给药结束后2 h，10%水合氯醛ip麻醉，在无菌环境下腹主动脉取血，4℃静置3 h，离心分离血清。将同组血清合并，并置56℃水浴灭活30 min，0.22 μm针头滤器过滤除菌，1 ml EP管无菌分装，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 细胞培养及药物干预制备Lewis肺癌细胞悬液，按常规细胞培养方法培养Lewis肺癌细胞，予扩增第6～8代生长良好的Lewis肺癌细胞进行实验。共分为4组，每组6个复孔，1×106个/孔接种于96孔板中，予含10%胎牛血清的BPMI1640培养液培养细胞24 h，培养液吸净，无血清RPMI1640培养液每培养孔加入200 μl，继续培养箱内培养24 h，使Lewis肺癌细胞同步化。再分别以含10%对照大鼠血清及低、中、高补肾方含药血清的RPMI1640培养Lewis肺癌细胞，每孔200 μl。

1.2.3 CCK8检测T细胞增值能力含药血清药物干预后加入10 μl CCK8：培养1～4小时。测定450 nm吸光度：检测波长450～490 nm，参比波长600～650 nm。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期取生长状态良好的Lewis肺癌细胞配制成密度为1.0×105/ml接种于24孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度(低、中、高剂量组以及NS对照组)含药血清1 ml，细胞培养箱内继续培养72 h，予不含EDTA的胰蛋白酶后，收集置1.5 ml离心管后离心5 min，0.9%NS清洗2次，弃上清，加入预冷的70%乙醇1 ml，固定4℃过夜。固定液，PBS清洗2次，加4 ℃预冷PBS 500 μl重悬细胞，后加RNase A、PI避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期情况。

2 结果

2.1 补肾填精方含药血清干预抑制Lewis肺癌细胞的生长采用倒置显微镜观察低、中、高浓度含药血清干预对细胞密度的影响。Lewis肺癌细胞接种后，分别给予对照组、低剂量、中剂量和高剂量的补肾填精方含药血清干预细胞24 h后，在10×和20×的显微镜下观察细胞密度。与对照组相比，不同浓度的含药血清干预显著降低肺癌细胞密度，浓度越高，抑制越明显。实验结果见图1。

图1 显微镜观察Lewis肺癌细胞密度的影响

2.2 对Lewis肺癌周期的影响与正常对照组比较，实验组3组均可显著增加G2/M期细胞的百分比(P<0.05)，根据实验结果显示，高剂量补肾填精方组G2/M期细胞百分比为最高(15.59%)，这提示补肾填精方含药血清可以通过诱导细胞周期阻滞到G2/M期从而抑制Lewis肺癌细胞。见表1。

表1 补肾填精方作用于A549细胞72 h细胞周期时相分布 (只，

注：与对照组比较，1)P<0.05

2.3 补肾方干预显著抑制Lewis肺癌T细胞活力采用CCK-8检测补肾方含药血清干预对Lewis肺癌T细胞活力的影响。Lewis细胞分别经不同浓度的补肾方含药血清干预24 h后，采用CCK8检测细胞活力，与对照组相比，P<0.05。与对照组(100%)相比，不同浓度的补肾方含药血清干预能够显著降低Lewis肺癌细胞的活力，且呈现剂量依赖(P<0.05)。可见，补肾填精方含药血清具有显著降低Lewis肺癌细胞活力的作用。实验结果见图2。

图2 CCK-8检测补肾方含药血清干预对Lewis肺癌细胞活力的影响

3 讨论

肺癌属于中医学“胸痛、喘证、肺积、哮证、咯血、咳嗽”等范畴。肺为肾之母，肺癌发病日久，子病及母，久则肾精耗伤，肾气肾阴阳亏虚，反致肺脏亏虚，肺失宣降失职，外邪侵袭，留置肺络，痰湿、瘀血内阻成瘤。肺肾亏虚，痰湿瘀血内阻为肺癌形成的主要病机之一。肾藏精，为先天之本，肾主一身阴阳，为元阴元阳之守；而肾为水，肺为金，金能生水，水能润金，故金水相生法、补肾培元为肺癌治疗大法。《素问·阴阳应象大论》说:“肾生骨髓”。及目前“肾虚致瘤”学说。目前研究显示，肾虚影响机体免疫功能，补肾能提高机体免疫功能[3]。免疫功能与中医学的肾主骨生髓密切相关，现代研究中认为骨髓干细胞有造血功能，体液及细胞免疫调节免疫反应，皆是中医学“肾”功能的一个组成部分。而肾主封藏失职，则能量失守，能量失守是肿瘤发生的根本原因。

本实验中补肾填精方由枸杞子、制何首乌和淫羊藿三味药组成，方中枸杞子性味甘平，归肝肾经，具有滋补肝肾，精血明目之功。近代研究发现枸杞子含有的枸杞多糖通过调节细胞因子表达影响T细胞免疫[4]。梁淑轩等[5]将枸杞多糖硒化后发现其抗肿瘤能力更显著，且呈剂量依赖性。何首乌味苦甘涩，性微温，归肝肾经，具有补肝肾、益精血，强筋骨之功。《本草纲目》谓之能养血益肝，固精益肾，为滋补良药，不寒不燥，功在地黄、天冬诸药之上”。制何首乌多糖[6]具有增强巨噬细胞吞噬能力，具有较好增强免疫功能。淫羊藿味辛、甘，性温，具有补肾壮阳，强筋健骨的功效。现代研究证实，淫羊藿苷可通过调节细胞周期调节Caspase-3、9，周期蛋白A、B1，CDK2，p21等蛋白及基因表达从而发挥抗肿瘤作用[7]。其提取物淫羊藿苷可通过恢复T细胞功能，提高机体免疫功能，进而产生抗肿瘤免疫[8，9]。基于肾为水火之宅，内有人体阴阳之源，三药合用，枸杞子、制何首乌补肾中之阴，淫羊藿补肾中之阳，立足于补益肾气，共奏补肾调元，培补阴阳，金水相生之效。

在内外因素下，机体功能失调，内环境紊乱，特别是机体免疫功能及免疫微环境的破坏是导致肿瘤发生及发展的主要原因。基于调整肿瘤免疫微环境的治疗大法，肺癌的免疫治疗已经广泛运用于临床，疗效确切。而中医学大量研究证实，金水相生法可明显改善肺部症状。因此，其机理可能与金水相生法能改善机体免疫功能，诱导细胞凋亡有关。本研究证实补肾填精方对肺癌细胞具有一定的抑制作用，其中以高剂量中药组对肺癌细胞影响效果更佳。从CCK检测T细胞增值能力，提示高剂量的补肾填精方对肺癌细胞有抗肿瘤免疫调节作用。与对照组相比，P<0.05。补肾填精方含药血清可以通过诱导细胞周期阻滞到G2/M期从而抑制Lewis肺癌细胞生长。

毋庸置疑，一定剂量的补肾填精方对Lewis肺癌细胞具有一定的肿瘤抑制作用，根据对T细胞活检影响，我们推测补肾填精方对Lewis肺癌细胞可能具有抗肿瘤免疫调节作用，改善肿瘤的免疫微环境作用。但其抗肿瘤通过哪些信号通路机理不明，后期研究中将进一步明确其机理，以期能更好地运用于临床，发挥中医抗肿瘤优势。