MMP-9和TIMP-1在各期大鼠压力性损伤模型中的表达及意义

张亚楠 李贤

(承德医学院，河北 承德 067000)

已有研究显示压力性损伤在德国院外发生率为21%，院内发生率为0.78%〔1〕；我国调查发现院内压力性损伤发生率为0.628%〔2〕。研究表明〔3，4〕，压力性溃疡的形成与基质金属蛋白酶(MMP)和MMP组织抑制剂(TIMP)因子之间失去平衡有关。研究表明大鼠5个缺血循环再灌注的损伤组织中比3个缺血循环再灌注的损伤组织中MMP-9的表达升高〔5〕。本文拟观察MMP-9和TIMP-1在各期大鼠压力性损伤模型中的表达情况。

1 材料与方法

1.1实验动物 64只健康雄性大鼠购于河北医科大学实验动物中心，体重(380±20)g，动物合格证编号为1607106。

1.2实验器材、试剂 圆片形铁片(直径15 mm,厚0.3 mm,重0.6 g，高压灭菌消毒)、 圆形磁铁(直径15 mm,厚5.0 mm,重2.6 g，磁通量高达1500高斯)购自河北超强磁业技术有限公司。抗体MMP-9(PAA553Ra01)抗体TIMP-1(PAA552Ra01)购自美国Cloud-Clone公司。

1.3动物分组 健康雄性SD大鼠适应性饲养1 w,按随机数字表随机分为空白组、对照组、1期压力性损伤组(1期组)、2期压力性损伤组(2期组)、可疑深部组织损伤组(可疑组)、3期压力性损伤组(3期组)、不可分期组、4期压力性损伤组(4期组)各 8只。

1.4压力性损伤模型的复制 参照文献〔6，7〕，利用缺血循环再灌注的方法复制各期压力性损伤模型。首先禁食水8 h，用10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，用配置好的脱毛剂(8 g硫化钠+20 ml酒精+80 ml水)进行臀部脱毛，然后用安尔碘进行臀部消毒，在左臀部靠近头端剪2 cm×2 cm的切口，用无菌钳子和镊子钝性分离臀部肌肉，最后将铁片放到肌肉下，通过筋膜固定铁片，缝合切口。让大鼠带铁片适应性生活3 d,没有感染现象的在体外加压磁铁2 h，拿下磁铁让局部组织充血循环再灌注0.5 h，每天5个循环，直到复制出各期压力性损伤模型。8组同一时间植入铁片，采取先复制4期压力性损伤模型，再复制不可分期，以此类推，使4期2个阶段的压力性损伤模型在同一时间复制完成，最后在同一时间杀死8组大鼠，保证了铁片在每组中植入的时间相同，降低铁片对实验结果的影响。

1.5组织学观察 各期压力性损伤组织通过苏木素-伊红(HE)染色观察病理学变化，采用免疫组化法测定各期压力性损伤中的MMP-9和TIMP-1水平，其中一抗用1∶200的比例进行稀释。光镜观察，结果以胞质或胞膜着棕色为阳性染色。在400倍光镜下观察免疫组化结果，在光镜下每组取3张片子，每张片子随机取5个视野，计算阳性细胞数并以百分数表示，分别测定MMP-9和TIMP-1阳性表达率，取其均值并计算MMP-9/TIMP-1的比值。

1.6成膜判断标准 1期：皮肤完整，表面有不褪色的压红；病理学表皮鳞状细胞缺失，病灶部位有少量中性粒细胞。2期：皮肤红肿，呈现暗红色，无流血流脓；病理学表皮大部分缺失，浅部真皮层有淋巴细胞和中性粒细胞浸润。可疑深部组织损伤期：受压部皮肤颜色变紫色或黑色,周围红肿加重,按压周围红肿处皮肤流出少量淡黄色组织液；病理学表皮大部分缺失,真皮层有溃疡产生且伴有多量炎性细胞浸润。3期：受压处皮肤变黑变硬,针刺不出血,将表面的黑色皮肤清创后,露出脂肪但还看不见肌肉、肌腱或是骨骼；病理学真皮层有大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，损伤到肌肉层，臀大肌肌纤维变松，且有炎性细胞浸润。不可分期：受压处皮肤变黑变硬,针刺不出血，周围渗出黄色液体,清除坏死组织和焦痂后,露出表层肌肉；病理学表皮层和真皮层消失,代之以肉芽组织,伴重度炎症和出血,臀大肌萎缩甚至消失,深层肌肉局部萎缩,横纹消失纤维化伴慢性炎症。4期：铁片边缘皮肤红肿糜烂,有渗液或渗血,伴有骨骼、肌腱或肌肉暴露；病理学臀大肌消失,深层肌肉多灶状炎性坏死,伴化脓性炎症,部分间质水肿出血及大片纤维化。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件进行正态性检验、方差齐性检验、Kruskal-WallisH检验。

2 结 果

2.1复制模型结果 1个循环后形成1期压性损伤，5个循环后形成2期压力性损伤，15～20个循环后形成深部组织损伤，20个循环后形成3期压力性损伤，20～25个循环后形成不可分期，30个循环后形成4期压力性损伤。在整个实验过程中1期组再造摸过程中1只大鼠可能是由于手术器械伤及内脏而死亡，其他组均无死亡，成功复制模型。

2.2MMP-9和TIMP-1在各期压力性损伤组织中的表达 见表1，图1、2。

表1 各组组织中MMP-9和TIMP-1的阳性表达率

与空白组相比：1)P<0.05；与对照组相比：2)P<0.05；与1期组相比：3)P<0.05；与2期组相比：4)P<0.05；与可疑组相比：5)P<0.05；与3期组相比：6)P<0.05；与不可分期组相比：7)P<0.05

图1 各组MMP-9的表达(HE，×400)

图2 各组TIMP-1的表达(HE，×400)

MMP-9和TIMP-1在空白组和对照组中几乎不表达，且两组的表达情况没有统计学差异(P>0.05)，铁片对实验结果没有干扰；随着压力性损伤程度的加深，MMP-9表达不断地增加，TIMP-1表达先上升，在4期组开始降低，MMP-9/TIMP-1的比值不断显著增大(均P<0.05)。

3 讨 论

压力性溃疡具有极大的危害，探究压力性损伤形成的机制，找到预防压力性损伤的靶点，可以有效降低压力性损伤的发生率。

MMP-9的表达可以促进受压部位组织细胞外基质的降解，从而造成受压组织的不可逆性损伤。MMP是一组降解细胞外基质的蛋白酶〔7〕，受许多细胞因子的调节，在伤口的愈合和疾病的恢复过程中起着至关重要的作用。其中MMP-9的过度表达会促进细胞外基质的降解，从而使压力性损伤的损害不可逆。本研究中，随着受压循环的增多，受压组织进一步恶化，MMP-9表达显著增加，细胞外基质降解，使组织易损性增加。研究证明〔8〕，MMP-9在慢性感染创面中的活性较急性创面中高出近125倍，而生长因子水平却明显低下。压力性损伤的伤口属于慢性伤口，因此可以推测出，压力性损伤的形成过程也是通过MMP-9表达增多从而抑制生长因子，使伤口变为不可逆损伤。

研究表明TIMP-1和MMP-9关系密切，TIMP-1主要由炎性细胞和结缔组织细胞产生，广泛存在于组织和体液中，其主要功能是与MMP-9形成1∶1的复合物从而抑制MMP-9活性。然而TIMP-1的表达也受MMP-9表达程度的控制，MMP-9的过高表达也会抑制TIMP-1的分泌，从而形成恶性循环促进压力性损伤的发生发展。本研究发现随着受压循环次数的增多及压力性损伤严重程度的加深，TIMP-1的表达呈先上升后下降趋势，MMP-9的表达增多反过来抑制TIMP-1的表达，从而使压力性损伤向更深程度发展。

正常皮肤组织中MMP-9/TIMP-1表达很少或基本不表达，对正常皮肤的维护作用不大，在创伤和炎症时机体精确调控炎性细胞和修复细胞合成分泌MMP-9/TIMP-1〔7〕。本实验可见MMP-9/TIMP-1的表达失衡是压力性损伤发展的一个重要因素。部分生长因子在压力性损伤治疗过程中并不能达到预期的效果，这可能与局部增多的MMPs加快了生长因子和生长因子的降解有关，因此在早期压力性损伤治疗过程中，在生长因子的干预下增加MMPs的抑制剂，从而达到抑制MMPs的活性，预防早期压力性损伤向深部压力性损伤发展，提高早期压力性损伤的治愈率。

本研究证明了MMP-9的高表达可以抑制TIMP-1的表达，导致MMP-9/TIMP-1的比例失衡是促进压力性损伤发生发展的重要因素。MMP-9的表达不但加速了受压组织的损坏而且会降解生长因子，从而减慢了受压部位组织的自身修复。如何调控MMP-9/TIMP-1在各期压力性损伤组织中的表达，使MMP-9/TIMP-1成为预防压力性损伤发生发展干预的靶点。