自主运动对高脂饮食诱导的肥胖小鼠膝骨关节炎软骨形态学的影响

宗文浩 李可峰 郭炜炜 刘洋 代路路 毕军 沙继斌 吴燕 闫前 田雪文 董贵俊*

1.山东体育学院，山东 济南 250102 2.山东省委党校卫生科，山东 济南 250103 3.上海体育学院运动科学学院，上海 200438

骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是一种常见的退行性骨关节疾病，中老年人发病率较高，特别是肥胖的中老年人。在美国60岁及以上人群中，膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的发病率男性约为10%，女性约为13%，且随年龄的增长及肥胖的流行而不断提高[1]，预计到2020年，美国将有超过5千万人遭受此病困扰，成为造成40岁以上人群残疾及活动受限的一个重要影响因素[2]。从发病特征来看，OA最常见于髋、膝等负重关节，以关节疼痛、活动受限以及关节软骨退变为主要特征[3]。除关节软骨外，受累及部位还包括滑膜、韧带、半月板以及关节周围肌肉等[2]。对于OA的发病机制目前尚缺乏统一认识，受肥胖、代谢综合征、饮食改变、静坐少动的生活方式或运动不当等“现代环境”因素影响较大[4]。传统观点认为，OA仅仅是由衰老以及运动创伤导致的机械应力改变所引起的关节疾病，但大量的流行病学及生物学数据表明[5-9]，OA与代谢性及炎性因素密切相关，因此有学者提出“代谢性骨关节炎”(metabolic OA)的概念[10]，并将代谢性OA列为代谢综合征(metabolic syndrome，MetS)的第五大组成部分(除肥胖、高血压、血脂异常及高血糖外)[11]。

关节软骨是骨关节的主要承重结构，它覆盖于骨关节表面，缓冲并传导力学冲击。主要由软骨细胞及细胞外基质构成，内无血管及神经，是OA的主要病变部位[12]。目前并没有完全治疗OA的有效方法，临床治疗主要以缓解疼痛以及增加软骨营养供应为主，手术治疗存在风险大、术后并发症多等问题[13]，因此寻找有效预防治疗OA的策略是科研及临床工作者的迫切任务。在众多OA治疗方法当中，运动训练以其无创、高效、持久的特点在OA发生发展过程中扮演着重要角色，跑步是一种常见的运动方式。Jeffrey等[14]在对大鼠进行30 km/3周和55 km/6周跑步运动后发现，两个周期不同距离的运动均降低了关节软骨蛋白聚糖含量，增加了MMP-13的表达，表明运动促进了大鼠OA的发展；而Paul等[15]研究发现，每周至少运动12.4 km能够显著降低患OA风险。可见，跑步运动对OA的干预作用，尚存在较大争议。

因此，本研究通过高脂饮食诱导C57BL/6 J雄性小鼠发生膝骨性关节炎病变，从而建立骨关节炎模型，并进行3周自主转轮运动干预，观察运动对膝关节软骨形态学改变，探究自主转轮运动对膝骨关节炎软骨的保护作用，以期为临床治疗代谢性膝骨关节炎提供有效的实验证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8周龄C57BL/6 J雄性小鼠28只，初始体重为(20±2)g,购自山东大学实验动物中心，饲养于山东体育学院动物实验室，所有实验操作均符合山东体育学院动物实验伦理委员会的要求。

1.2 实验方法

1.2.1实验动物分组：适应性喂养4周后，12周龄小鼠随机分为正常饮食组(control diet-sedentary，C-Sed组，n=6)，正常饮食加运动组(control diet-exercise，C-Ex组,n=6)，高脂饮食组(high fat diet-sedentary，HF-Sed组,n=8)以及高脂饮食加运动组(high fat diet-exercise，HF-Ex组,n=8)。C-Sed和C-Ex组喂养基础饲料(13.5% kcal)，HF-Sed和HF-Ex组喂养高脂饲料(60% kcal，货号D12492，北京科澳协力饲料有限公司提供)。经12周不同膳食干预后，参照沙继斌[16]等的研究结果，选取HF-Sed组体重超过C-Sed组均值20%的小鼠作为肥胖小鼠模型。实验动物单独分笼饲养，自由饮食，12 h昼夜交替，环境温度(22±1)℃，相对湿度50%～55%，每周日早上8点测空腹体重。

1.2.2运动方案：运动组小鼠喂养8周结束后，适应性训练1周，第10周开始正式使用自主转轮运动系统(图1)计量运动量。小鼠自由运动，每转一圈，磁感应器计数一次，第二天早上8点记录每只小鼠所转圈数并清零重新计数，共计3周。

图1 小鼠自主转轮运动系统Fig.1 The voluntary wheel-running exercise system of mice

1.3 标本取材及其处理

表1 改良Mankin评分标准(总分14分)Table 1 The modified Mankin score

注：OA早期：1～6分; OA中期：7～9分;OA晚期：10～14分。

12周喂养结束，用乙醚麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，用咬骨钳分别于左侧膝关节上、下方各1 cm处剪断股骨和胫骨，剔除关节周围肌肉、韧带以及髌骨等多余组织，注意不能伤及软骨表面，后将整个关节浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA脱钙液室温下脱钙4周，每3天更换一次脱钙液，以针头能轻松刺入骨骼视为脱钙完全。脱钙完成后，沿正中矢状面将其分为内、外侧两部分，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋，连续作4 μm切片，分别行苏木精-伊红(HE)、甲苯胺蓝染色。

1.4 软骨组织形态学观察

1.4.1HE染色：取部分石蜡切片，常规脱蜡至水，苏木精染色2 min，蒸馏水洗4 min，1%盐酸酒精分色5 s，水洗返蓝，伊红滴染1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。HE染色主要用于观察软骨表面结构是否平整，有无血管翳形成、裂隙及其严重程度(深达过渡层、辐射层、钙化层，甚至脱落)；细胞的分布、数量及排列是否规则，潮线是否完整。

1.4.2甲苯胺蓝染色：切片常规脱蜡至水，甲苯胺蓝软骨染色液染色1 min，镜下体积分数95%乙醇分化数秒，风干，二甲苯透明，中性树胶封片。甲苯胺蓝染色主要用于观察软骨基质失染程度，即软骨蛋白多糖含量。

1.4.3OA关节软骨退变程度评价：根据改良Mankin评分标准[17]，由两名观察者采用双盲法对各组HE及甲苯胺蓝染色切片进行评分，取两者平均值作为最后得分。总分为14分，得分越高表明OA关节软骨退变程度越高(表1)。

1.4.4胫骨透明软骨层厚度测量：每隔100 μm取一张切片进行HE染色，每个样本分别于内、外侧各取3张切片，测量胫骨透明软骨层(从软骨表面至潮线表面)厚度。在40倍光镜下，以胫骨平台负重区为中心[18]，左右每隔25 μm各取五点，共取11点，分别测量各点透明软骨厚度，最后取平均值。

1.5 统计学处理

2 研究结果

2.1 饮食及运动对C57BL/6 J小鼠体重、运动距离的影响

如图2所示，12周不同膳食干预后，HF-Sed组8只小鼠中有6只体重超过C-Sed组体重均值(27.8 g)的20%，即大于33.4 g，HF-Sed组小鼠平均体重是C-Sed组小鼠平均体重的1.36倍,差异具有统计学意义(P<0.01),表明12周高脂饮食诱导C57BL/6 J小鼠发生了肥胖；就运动而言，与HF-Sed组相比,HF-Ex组小鼠体重明显降低，两者之间比较差异具有统计学意义(P<0.01),表明3周自主转轮运动起到了降低体重的作用，但正常饮食组之间比较差异并无统计学意义(P>0.05)。尽管高脂饮食显著提高了HF-Sed组小鼠体重，但却未能明显改变其运动距离。如图3结果显示，C-Ex组与HF-Ex组两组小鼠运动距离相似，两者之间比较差异无统计学意义，表明不同膳食没有对小鼠的运动距离产生影响。

图4 各组小鼠膝关节软骨组织形态学染色结果 图a～图d为各组小鼠膝关节软骨组织HE染色(40×)，图e～图h为甲苯胺蓝染色(40×)。Fig.4 Morphological results of knee joint cartilage in different groups of mice

图2 各组小鼠体重变化(与C-Sed组比较，**P<0.01；与HF-Sed组比较，##P<0.01)Fig.2 The body weight change of mice in different groups

图3 两组小鼠每天平均运动距离比较Fig.3 The average daily exercise distance of the two groups of mice

2.2 各组小鼠膝关节软骨组织形态学染色结果

C-Sed组关节软骨表面光滑，细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整无缺失，基质染色正常，软骨厚度适中；C-Ex组较C-Sed组软骨细胞增多；HF-Sed组与C-Sed组相比，软骨表面不规则，有裂隙出现，细胞排列紊乱，软骨基质淡染，部分潮线缺失，尤以股骨最为明显；HF-Ex组软骨表面较光滑，细胞排列较规则，软骨基质中度失色。见图4。

2.3 小鼠膝关节软骨Mankin评分结果比较

图5 小鼠各部位关节软骨Mankin评分结果(*P<0.05;**P<0.01)Fig.5 Mankin score of articular cartilage in different parts of joints

对小鼠膝关节内侧胫骨、内侧股骨、外侧胫骨以及外侧股骨四个部位关节软骨进行Mankin评分，探究饮食及运动对小鼠关节软骨退变的影响。经统计发现，由饮食及运动引起的最大改变是在小鼠膝关节内侧部分，高脂饮食增加了其内侧部分的Mankin评分分值(图5 A,图5B)，虽然在外侧部分Mankin评分升高，但只在外侧胫骨C-Sed与HF-Sed两组之间有统计学意义(图5C,图5D)；3周自主转轮运动降低了小鼠膝关节胫骨内侧的Mankin评分分值(P<0.05)。

2.4 各组小鼠膝关节胫骨内外侧透明软骨层厚度比较

从表2中可以看出，与C-Sed组相比，高脂饮食引起了HF-Sed组小鼠膝关节胫骨内外侧透明软骨的显著性改变,其中以内侧改变最为明显(P<0.001)；施加运动干预后，与C-Sed组相比，C-Ex组小鼠内侧软骨厚度有所增加，但无统计学意义，外侧软骨厚度基本保持不变(P<0.05)；HF-Sed组与HF-Ex组两者内侧透明软骨厚度比较差异有统计学意义，说明自主转轮运动阻止了HF-Ex组小鼠软骨厚度的进一步降低，延缓了其软骨退变进程。

表2 各组小鼠膝关节胫骨内外侧透明软骨厚度比较Table 2 Thickness of hyaline cartilage in medial and lateral tibia of knee joint in different

注：与C-Sed组比较，*P<0.05，***P<0.001；与HF-Sed组比较，###P<0.001。

3 讨论

3.1 高脂饮食及运动对C57BL/6 J小鼠体重、运动能力的影响

随着人们生活水平的不断提高、生活习惯及膳食结构的改变、大量高糖高脂膳食摄入及运动量的减少，致使肥胖人群不断增加，大量研究表明[19-21]，肥胖是诱发高血压、糖尿病、心血管病以及骨关节病等慢性疾病的罪魁祸首。本研究通过12周高脂饮食，发现高脂饮食组小鼠体重明显高于正常饮食组，成功建立了动物肥胖模型，且经3周自主转轮运动干预后，高脂饮食加运动组小鼠体重明显减轻，提示运动起到了降低体重、减肥的作用。但Griffin等[3]的研究结果发现，4周自主转轮运动并未使高脂饮食加运动组小鼠体重降低，造成结果不一致的原因可能是本研究高脂饮食加运动组小鼠每天运动距离大于上述研究，能量消耗较高。在相同运动时间内，正常饮食加运动组小鼠与正常饮食组相比，体重无较大改变，很可能是由于正常饮食组小鼠体重本身处于正常范围内，3周运动增强了其肌肉含量，并未起到降体重的作用。Takamine等[22]研究结果显示，肥胖组与正常组两组大鼠自主转轮运动总距离之间比较差异无统计学意义，与本研究结果相类似，结果提示高脂饮食并未使小鼠运动能力发生改变，这好像有悖于常理。以往研究[23-24]发现，体重与身体活动水平呈负相关，也就是说，体重越大者，身体活动水平越低，分析其中的原因，可能是由于高脂饮食喂养时间较短，造成的肥胖程度较低，因而未达到活动受限的程度。但也有研究发现，身体活动水平与体重之间并不存在明确的关联，例如，王欢等[25]通过对中老年肥胖男性身体活动水平与能量消耗特征研究发现，肥胖人群的身体活动量和每日消耗能力并不低于体重正常组。

3.2 高脂饮食及运动对小鼠关节软骨形态结构的影响

肥胖与OA是世界范围内普遍存在的两大健康问题，肥胖在OA发生发展中的作用已得到许多研究结果的证实，肥胖除增加个体负重关节负荷外，代谢因子紊乱也是诱发OA的主要因素[26]。本研究的目的在于通过高脂饮食诱导小鼠发生膝骨关节炎并进行3周自主转轮运动，以探究自主运动对膝骨关节炎小鼠软骨形态结构的改善作用。近期研究表明[27-28]，高脂饮食诱导的肥胖能够导致关节软骨OA样改变，且能够加速OA发展进程。本研究结果发现，12周高脂饮食喂养后，高脂饮食组小鼠软骨表面出现纤维样改变，严重者表面软骨层缺失，HE染色结果显示潮线不完整且软骨细胞减少，透明软骨层厚度降低，甲苯胺蓝染色淡染即蛋白多糖减少，与Mankin评分结果相一致，结果提示12周高脂饮食诱导C57BL/6 J小鼠早期OA的发生。Mankin评分结果以及透明软骨层厚度测量结果显示，高脂饮食所造成的最大改变是在内侧部分，与前人[3]研究结果一致，造成KOA软骨内外侧严重程度差异的机制尚不完全清楚，尽管一些研究[29]发现这可能与内外侧髁受力不均匀有关。

本研究采用自主转轮运动，让小鼠在自由状态下进行转轮运动，试图模拟动物以及人类在自由状态下进行运动的效应。结果显示，两组小鼠每天运动距离之间比较差异无统计学意义，运动距离适中。与跑台等强迫性运动相比，自主转轮运动较为随意，运动训练过程不受外界控制，即运动负荷强度无法人为调节。总的来说，3周自主转轮运动对小鼠关节软骨的影响是适度的，运动并没有增加由饮食引起的肥胖小鼠膝关节任何部位OA评分的增加，但在内侧胫骨部分，运动延缓了OA的进展。关节软骨是附着于关节表面的一层结缔组织，主要由软骨细胞及细胞外基质构成，内无血管、淋巴管及神经组织，自我修复能力差[30]。关于运动对关节软骨的作用，目前普遍认为，一定强度的运动负荷刺激能够维持关节软骨正常生理特性[31],而缺乏运动，比如长期关节制动能够导致关节软骨机械特性的下降以及蛋白聚糖含量丢失，最终造成关节软骨中度降解[32]。在Tee等[29]的研究中，给予高脂饮食诱导的小鼠6周低强度振动刺激，结果发现内侧关节软骨厚度显著增加，与本研究结果相类似，相较于HF-Sed组，3周自主转轮运动明显增加了HF-Ex组小鼠内侧关节软骨透明软骨层厚度，外侧无较大变化。在正常饮食组，运动虽未引起透明软骨层厚度显著性增加，但与C-Sed组相比，C-Ex组小鼠透明软骨层厚度增加6.5%。以上结果提示，3周自主转轮运动对关节软骨所造成的影响是积极的。

当然，本实验也存在局限性。首先，本研究并未探讨造成KOA的原因，且由于3周自主转轮运动降低了HF-Ex组小鼠体重，因此不能排除体重降低对运动延缓OA进程的干扰，这一点不是很理想。但运动后C-Ex组小鼠体重并未降低，且膝关节胫骨内侧透明软骨厚度增加，表明3周自主转轮运动对软骨的影响是有利的。此外，KOA是一种全关节疾病，若将软骨下骨等其它部位参数考虑在内，将有助于进一步揭示饮食及运动对KOA的影响。

4 小结

12周高脂饮食喂养可诱导C57BL/6 J小鼠肥胖并发生膝骨性关节炎，3周自主转轮运动干预在一定程度上延缓并改善了由高脂饮食引起的膝骨性关节炎的发生发展。本文主要探讨了饮食及运动对膝关节软骨形态学的影响，但究其变化机制需要在今后的研究当中进一步探索。