组培脱毒嘉定白蒜原原种生产的技术关键点试验研究

赵 硕 黄丹枫* 高 畅 杨 飞 赵颖雷 郏颖杰 郏惠彪

（1上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2上海蔬菜研究所，上海 201899；3上海惠和种业有限公司，上海 201899）

嘉定白蒜（Aillum sativumL.）是我国著名的大蒜品种之一，已有近百年的种植历史，以其色泽洁白，蒜头肥大，鳞芽6～8瓣，肉质脆嫩，辣味浓烈，贮藏性好而著称，已被国外许多国家作为贵重药品、滋补饮料、保健食品以及美容化妆品的制作原料。嘉定白蒜在国际市场上享有盛誉，特别是其种蒜在国际市场上一直有较强的竞争力，需求旺盛（薛友英，1999；李贤 等，2018；高畅 等，2019）。

大蒜虽然种质资源丰富，但由于其花器官不能正常进行减数分裂（彭爱芳 等，2014），无法形成可育的种子，因此在生产实践中主要采用前一年收获的鳞茎（蒜瓣）作为营养体繁殖播种，但鳞茎同时又是大蒜的产品器官，病毒极易通过其积累和传播（陈世儒和黄菊辉，1991；杜永芹 等，2004；高晖和王振英，2017）。采用组织培养的方法可以有效脱除大蒜主要病毒（李贤 等，2018），还可以解决因连年种植大蒜而造成的种性退化等问题，提高繁殖系数，达到高效、增产的目的（王学利 等，2002；高畅 等，2019）。为了最终实现大蒜脱毒种苗产业化的目标，还需要对脱毒后的组培苗或组培鳞茎培育成大蒜原原种（嘉定白蒜经组培脱毒后以组培苗或组培鳞茎的形式进入田间繁育，生产上将一代称为原原种，二代称为原种，三代称为生产种）的关键技术开展研究，分析大蒜组培脱毒后原原种繁育的影响因素以及脱毒种蒜生产的技术关键点。

本试验以脱毒嘉定白蒜为试材，重点研究了水肥供给对组培苗和组培鳞茎的大蒜苗长势及原原种质量的影响，同时研究了继代次数和组培鳞茎播期对原原种质量的影响，然后进行了脱毒原种和常规出口蒜种的生产比较试验，以期为实现嘉定白蒜脱毒种苗的产业化提供技术支持。

1 材料与方法

本试验中的脱毒组培苗、鳞茎等所用品种均为嘉定白蒜，由上海惠和种业有限公司提供。

1.1 水肥供给试验

1.1.1 试验材料 筛选获得相近规格的组培苗：具有3片以上绿叶，茎粗2.5～3.5 cm；筛选获得相近规格的组培鳞茎：直径0.5～0.8 cm。

1.1.2 试验方法和测定项目 采用四因素两水平完全区组试验设计。每个处理1个穴盘，5次重复，脱毒组培苗与组培鳞茎各820株。田间处理组合与编号如表1所示。

表1 试验处理组合与编号

试验在上海惠和种业有限公司连栋温室中进行。使用潮汐式肥水一体化灌溉系统进行育苗水肥的精准控制。补水频次通过盘重控制，潮汐式灌溉液面高度3 cm，记录灌溉日期。使用水溶肥（上海永通化工公司生产的花无缺大量元素水溶肥：总氮20%，水溶性磷20%，水溶性钾20%）配制营养液，EC值控制在1.2～1.8 mS·cm-1，补肥时人工定量浇灌，不施肥的处理同时浇清水。

2018年4月3日将试验材料移栽至穴盘并摆入苗床，于4月17日、5月2日、5月17日每盘随机取5株，用直尺测定株高，以植株地上部分垂直高度为株高，在距地面2 cm处用游标卡尺测定假茎粗。6月27日精准收获全部鳞茎，测定鳞茎的鲜质量。

1.2 继代次数试验

1.2.1 试验材料 8代和15代组培鳞茎，直径0.8～1.0 cm。

1.2.2 试验方法和测定项目 采用完全区组试验设计，3次重复，每次重复包括2个穴盘，共移栽组培鳞茎600株。试验在上海惠和种业有限公司青冈基地塑料大棚中进行。分别将8代和15代组培鳞茎在4～10 ℃低温条件下处理20 d，然后于2018年10月13日播于50孔穴盘中，将品氏泥炭、珍珠岩和蛭石按照7∶2∶1的体积比混拌成育苗基质，并在育苗基质中加入10%的有机肥。

2019年3月3日、4月2日、5月2日分别统计腋芽生长现象（次生生长）发生的比例，计算次生生长率，同时每盘随机取5株分别统计总叶片数和绿叶数（绿叶数为总叶片数减去干枯叶片数），测定株高、假茎粗、全株以及鳞茎的干鲜质量，将样品置于105 ℃烘箱中烘20 min，然后烘箱温度调至80 ℃将样品烘至恒重测定干质量。

其中，全部植株数为长成的植株数，部分穴孔的鳞茎未长成大蒜苗则未计入。

2019年5月20日精准收获全部鳞茎，分别测定各处理鳞茎的直径和干鲜质量，并统计全部鳞茎中正常分瓣、次生分瓣以及独头蒜现象的比例。

1.3 组培鳞茎播期试验

1.3.1 试验材料 8代组培鳞茎，直径0.6～0.8 cm。

1.3.2 试验方法和测定项目 采用完全区组试验设计，3次重复，每次重复包括2个穴盘，共移栽组培鳞茎1 200株。试验在上海惠和种业有限公司青冈基地塑料大棚中进行。组培鳞茎先在4～10 ℃低温条件下处理20 d，然后分别于2018年9月28日、10月13日、10月28日、11月12日播于50孔穴盘中，将品氏泥炭、珍珠岩以及蛭石按照7∶2∶1的体积比混拌成育苗基质，在育苗基质中加入10%的有机肥。2019年5月20日统计次生生长发生的比例，并精准收获全部鳞茎，分别测定各处理鳞茎的干鲜质量和直径，并统计全部鳞茎中正常分瓣、次生分瓣以及独头蒜现象的比例。

1.4 原种生产的商品性比较试验

1.4.1 试验材料 常规大蒜种：常规用于出口的蒜种，单瓣质量≥5 g；脱毒大蒜原种：单瓣质量≥5 g；脱毒大蒜原原种：单瓣质量≥5 g。

1.4.2 试验方法和测定项目 不同处理一次重复包含60株样本，3次重复，共移栽540株。试验在上海惠和种业有限公司青冈基地塑料大棚中进行。试验地每667 m2施加有机肥1 000 kg，2018年9月26日播种。分别于2018年12月5日和2019年1月4日、2月3日、3月5日、4月4日，每个重复随机取5株分别统计总叶片数和绿叶数、株高、假茎粗，4月5日（抽蒜薹之前）每个重复随机取5株统计鳞茎分瓣数并测定全株和鳞茎的干鲜质量；5月20日收获后每个重复随机取5株统计大蒜鳞茎的分瓣数、直径以及干鲜质量。

1.5 试验数据处理与分析

采用SPSS 19.0软件处理试验数据并进行差异显著性分析，处理间均值多重比较利用Duncan’s新复极差法，采用Excel 2016软件进行数据整理。

2 结果与分析

2.1 水肥供给对大蒜苗生长及原原种鳞茎质量的影响

由表2和表3可见，不同组织类型培育的大蒜苗在生长上表现出显著的差异，穴盘规格、灌溉时间以及补肥间隔也均对原原种鳞茎鲜质量有显著影响，其中灌溉时间和补肥间隔对4月17日统计的株高也有显著影响。由表2可见，组培鳞茎获得原原种的鳞茎鲜质量均显著高于组培苗，在其他因素一致的情况下，穴盘孔径为32孔的T1、T2、T3、T4、T9、T11、T12处理获得的原原种鳞茎鲜质量分别显著高于50孔的T5、T6、T7、T8、T13、T15、T16处理；灌溉时间为30 min的T7、T12、T16处理获得的原原种鳞茎鲜质量分别显著高于灌溉时间为10 min的T5、T10、T14处理；补肥间隔为7 d的T7、T9处理获得的原原种鳞茎鲜质量分别显著高于补肥间隔为14 d的T8、T10处理。原原种鳞茎鲜质量较大的处理为T9、T11、T12处理，由于T12处理和T9、T11处理相比更加节肥，所以，选择T12处理（组织类型为组培鳞茎、32孔穴盘、灌溉时间30 min、补肥间隔14 d）为最佳组合。

表2 水肥供给对两种组织类型大蒜苗生长及原原种鳞茎质量的影响

表3 处理因素对大蒜生长指标影响的显著值

2.2 继代次数对大蒜苗生长及原原种鳞茎质量的影响

由表4可见，从3次统计的株高、假茎粗、总叶片数、绿叶数以及干鲜质量等生长指标来看，3月3日统计的15代组培鳞茎的全株鲜质量、鳞茎鲜质量、全株干质量和鳞茎干质量分别比8代组培鳞茎低17%、24%、27%和27%，差异显著；而4月2日统计的指标在处理间差异不显著；5月2日最后一次统计的15代组培鳞茎的株高、全株鲜质量及全株干质量均显著低于8代组培鳞茎，分别低13%、13%和20%。2种继代次数组培鳞茎的次生生长率在3次统计中差异均不显著。

由表5可见，15代组培鳞茎获得的原原种鳞茎中正常分瓣比例和独头蒜比例显著高于8代组培鳞茎，分别高11.34、10.66个百分点；次生分瓣比例则显著低于8代组培鳞茎，比8代组培鳞茎低22.33个百分点。

2.3 组培鳞茎播期对大蒜原原种鳞茎质量的影响

由表6可见，组培鳞茎播期对次生生长率有显著影响，次生生长率随着播期的延后呈下降趋势。9月28日播种的次生生长率显著高于其他3个播期，11月12日播种的次生生长率最低，分别比其他3个播期低22.00、11.66、5.00个百分点。不同播期也对原原种鳞茎质量产生了显著影响，9月28日和10月13日播种得到原原种的鳞茎干鲜质量以及直径均显著高于后播的10月28日和11月12日2个处理，且原原种鳞茎中正常分瓣的比例显著低于后播的2个处理，11月12日播种得到的原原种中正常分瓣的比例比9月28日高出5.50个百分点，次生分瓣比例则比9月28日低11.98个百分点。

2.4 脱毒原种生产的商品性比较试验

由表7可见，在5次田间统计中，脱毒大蒜原种和原原种的株高、假茎粗、总叶片数和绿叶数均显著高于常规大蒜种。由表8可见，抽薹前（4月5日）统计的脱毒大蒜原种和原原种的全株干鲜质量、鳞茎的干鲜质量、分瓣数也显著高于常规大蒜种，以脱毒大蒜原原种为例，其全株鲜质量、鳞茎鲜质量、全株干质量、鳞茎干质量、分瓣数分别比常规大蒜种高出49%、38%、85%、38%、127%。

由表9可见，5月20日收获时统计的脱毒大蒜原种和脱毒大蒜原原种的鳞茎干鲜质量以及直径均显著高于常规大蒜种，以脱毒大蒜原原种为例，其获得的鳞茎的鲜质量、干质量以及直径分别比常规大蒜种高出86%、124%和30%，而脱毒大蒜原种最终得到鳞茎的分瓣数显著低于常规大蒜种。

表4 继代次数对大蒜苗生长的影响

表5 继代次数对大蒜原原种鳞茎质量的影响

表6 不同播期对大蒜苗次生生长及原原种鳞茎质量的影响

表7 不同蒜种类型对大蒜苗生长的影响

表8 不同蒜种类型对抽薹前大蒜苗生长和鳞茎质量的影响

表9 不同蒜种类型对收获鳞茎质量的影响

3 讨论与结论

大蒜生产受水分、肥料的影响较大（王飞 等，2017），穴盘规格、灌溉时间和补肥间隔都影响着大蒜生长的水肥供给状况。本试验发现32孔穴盘比50孔穴盘更有利于原原种鳞茎鲜质量的提高。在工厂化育苗过程中，穴盘的选择应从生产管理、经济效益、作物特性和生长发育等方面加以综合考虑（Styer &Koranski，1997），从本试验结果来看，2种组织类型中最终获得原原种鳞茎鲜质量最大的处理均出现在32孔穴盘，鳞茎的质量相对大更符合生产的要求，因此，在大蒜原原种繁育过程中可以选择孔径相对大的穴盘。本试验结果表明，较短的补肥间隔和较长的灌溉时间有利于原原种鳞茎质量的提高。有研究表明适当提高追肥频率可以使施肥量在作物生长期内分布更加均匀，持续为作物提供营养（陈高听，2016），而潮汐灌溉过程中较长的灌溉时间能够促进幼苗的生长（高艳明 等，2016）。

继代培养是植物组织培养过程中的重要环节，也是离体保存种质资源的必要手段（齐静静 等，2014）。前人研究认为，影响植物离体快繁的因素除了培养条件、外植体类型外，继代次数也是一个重要因素（Duncan，1996）。本试验发现，15代组培大蒜鳞茎在3月3日和5月2日测定的部分生长指标（全株鲜质量、全株干质量）要显著低于8代组培鳞茎，这和前人的研究结果类似。李招文等（1989）研究发现黄虾花试管苗在第1、2代生长正常，而第3代后试管苗生长矮小、细弱、分化率逐步下降；齐静静等（2014）研究发现，第3代除虫菊组培苗总体植株生长健壮，而第5代组培苗则表现出了枝叶纤细和生长缓慢现象。在本试验中，15代组培鳞茎获得原原种的正常分瓣比例显著高于8代组培鳞茎，而次生分瓣的比例则显著低于8代组培鳞茎。次生分瓣主要是由于大蒜的次生生长造成的，这可能是由于8代组培鳞茎长势旺盛，伴随着次生生长现象的多发从而导致了鳞茎次生分瓣比例增加。通过综合比较，15代组培鳞茎尽管长势弱于8代组培鳞茎，但是次生分瓣比例低，且获得的原原种鳞茎干鲜质量和8代组培鳞茎差异不显著，所以在脱毒嘉定白蒜原原种繁育中推荐使用15代组培鳞茎。

本试验发现不同播期对大蒜的次生生长率产生了显著影响。次生生长是大蒜的生理畸形现象，会导致大蒜鳞茎的次生分瓣，在我国南、北各地均有不同程度的发生（陆帼一 等，1992）。大蒜次生生长发生的影响因素可归结为环境因子、栽培措施及遗传特性3个方面（陈广平，2008）。本试验发现次生生长率随着播期的延后呈下降趋势，且相对晚播（10月28日和11月12日）得到的原原种鳞茎中正常分瓣比例也要显著高于相对早播（9月28日和10月13日）的处理。程智慧和陆帼一（1991）在对苍山蒜的研究中也发现早播造成了次生生长的增加，但是有利于大蒜的初级生长和产量的提高。本试验发现相对早播的2个处理得到的原原种鳞茎的干鲜质量及直径都要显著高于相对晚播的2个处理。已有研究指出，大蒜早播，冬前积温高，大蒜生育进程加快，植株个体大，为花鳞芽的提早分化创造了物质条件，一定程度上有利于后期产量提高，但是同时也为大蒜发生次生生长创造了条件（严根元 等，1990）。因此推荐将嘉定白蒜的播期定于每年10月中下旬，此时播种有助于获得较高的产量，且可以减少大蒜次生生长现象的发生，从而提高收获大蒜中正常分瓣的比率。

国际市场对大蒜鳞茎有外形完整、皮色洁白、无霉变、无虫蛀以及含水量低等标准，这就对大蒜的鳞茎生产提出了更高的质量要求（陈广平，2008）。本试验发现脱毒大蒜原种和原原种在生长期的各项生长指标以及收获得到的鳞茎质量均显著好于常规大蒜种，这和前人的研究结果一致。周绪元等（2003）研究发现脱毒的3个苍山大蒜品种的蒜头产量均比未脱毒对照显著增产，且脱毒大蒜蒜头的经济性状表现优于对照。徐培文（1998）也发现脱毒蒜生长繁茂，蒜头平均增产32%～78%。

本试验结果表明，水肥供给、继代次数以及播期均对嘉定白蒜原原种的鳞茎质量有显著影响。通过水肥供给试验筛选出了最佳处理组合：组织类型为组培鳞茎、32孔穴盘、灌溉时间30 min、补肥间隔14 d；继代次数试验表明，15代组培鳞茎相比8代组培鳞茎更适合用于嘉定白蒜原原种繁育；将嘉定白蒜的播期定于每年10月中下旬更有利于获得较高的收益。通过生产比较试验，脱毒大蒜种相比常规大蒜种在生产上均表现出突出的优势。