异叶败酱化学成分及其生物活性

王雅婧， 穆丽华， 刘 屏*

（1.山西中医药大学，山西 晋中030619；2.中国人民解放军总医院药理药学研究室，北京100853）

异叶败酱Patrinia heterophylla Bunge 是败酱科败酱属多年生草本植物，其根茎或根与糙叶败酱的根茎或根混用，药材名墓头回［1］。文献报道墓头回对各类急慢性白血病细胞有抑制作用，并且临床上用于治疗白血病［2-3］。异叶败酱作为墓头回的药源植物，对其化学成分报道较少，为进一步明确异叶败酱中的药效物质基础，本实验对异叶败酱进行化学成分研究，并对其单体化合物进行抗肿瘤活性筛选。从中分离得到7 个化合物，化合物2 ～6 均为首次从该属植物中分离得到，化合物1 为首次从该植物中分离得到，化合物1 ～6 对白血病细胞有一定的抑制作用。

1 仪器与材料

高效 液 相 色 谱 仪 （日 本 Hitachi 公 司）；2000ES 蒸发光散射检测器（美国Altech 公司）；R1-102 示差检测器（日本Shodex 公司）；NP7000半制备液相泵（汉邦公司）；R200 旋转蒸发仪、中压反相色谱柱（瑞士Buchi 公司）；Bruker AV-ⅢHD 600 超导核磁共振仪（瑞士Bruker 公司）；Q-TOF 高分辨质谱仪（美国Sciex 公司）；YT-CJ-1ND 超净工作台（北京亚泰科隆技术有限公司）；MCO-15ACCO2 恒温培养箱 （日本Sanyo 公司）；DT5-2 离心机（北京时代北利离心机有限公司）；1420-012 酶标仪 （美国Perkin Elmer 公司）； ECLIPSE TS100 显微镜（日本Nikon 公司）；D-101大孔树脂（天津南开和成科技有限公司）；薄层层析硅胶GF254、柱层析硅胶100 ～200 目（青岛海洋化工厂）。分析纯石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等试剂（国药集团化学试剂有限公司）；色谱纯甲醇、乙腈（国药集团化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈公司）。RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司）；胎牛血清（美国HyClone 公司）；二甲基亚砜（美国Amresco公司）；CCK-8 试剂盒（Biosharp 生物科技公司）。

异叶败酱于2014 年采于河南省，经中国人民解放军总医院刘萍研究员鉴定为正品。

人早幼粒白血病细胞（HL-60）、人慢性粒细胞白血病细胞（K562） 均购于中国医学科学院肿瘤医院细胞中心。

2 提取与分离

干燥的异叶败酱全草（2 kg） 粉碎，75%乙醇回流提取3 次，过滤后减压浓缩得异叶败酱总浸膏。总浸膏加水成悬浮液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，取有机相层，用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，分别得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位63、112、36、95 g。取正丁醇部分用大孔树脂色谱进行分离，依次用30%、60%、95%乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩后得到30%、60%、95%部分浸膏。

将30%部分浸膏（50 g） 经硅胶柱（100 ～200目） 分离，以氯仿-甲醇-水（25 ∶1 ∶0、9 ∶1 ∶0、9 ∶1 ∶0.1、8 ∶2 ∶0.2、7 ∶3 ∶0.5） 梯度洗脱，共得到263 个馏分A1-263，通过薄层色谱检测，合并相同馏分。馏分A180-190合并后经硅胶柱，以氯仿-甲醇-水（9 ∶1 ∶0.1、8 ∶2 ∶0.2） 梯度洗脱，再经半制备HPLC （乙腈-水2 ∶8） 得化合物1（21.5 mg）。馏分A120-159合并后经中压反相柱以乙腈-水（1 ∶9、3 ∶17、1 ∶4、1 ∶3、3 ∶7） 梯度洗脱，得化合物2（12.1 mg）。

将60%部分的浸膏经硅胶柱色谱（100 ～200目） 分离，经氯仿-甲醇-水（9 ∶1 ∶0.1、8 ∶2 ∶0.2、7 ∶3 ∶0.5） 梯度洗脱，共得到245 个馏分B1-245，通过薄层色谱检测，合并相同馏分。馏分B93-100合并后经中压反相柱以甲醇-水 （5 ∶95 ～55 ∶45） 梯度洗脱得化合物3 （11 mg）。 馏分B60-70号合并后经中压反相柱以乙腈-水（3 ∶97 ～48 ∶52） 梯度洗脱，F23 重结晶得化合物4（16.4 mg），F26 重结晶得化合物5 （9.1 mg）。 馏分B77-91号合并后经中压反相柱以甲醇-水（5 ∶95 ～80 ∶20） 梯度洗脱，F30 重结晶得化合物6（8.8 mg），F40 重结晶得化合物7（10.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（甲醇）。ESI-MS m／z：485［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：1.78（1H，m，H-13），2.03（2H，m，H-6），2.13（1H，m，H-9），2.19（2H，dd，J ＝7.2 Hz，H-12），2.95（1H，q，J ＝7.8 Hz，H-8），3.15（1H，t，J ＝8.4 Hz，H-7），3.24（2H，m，H-10），4.04（1H，d，J ＝11.4 Hz，H-1），4.22（1H，m，H-11）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：93.5（C-1），140.0（C-3），116.4（C-4），34.1（C-5），40.9（C-6），73.3（C-7），49.0（C-8），42.7（C-9），62.2（C-10），69.6（C-11），103.4（C-1′），75.1（C-2′），78.1（C-3′），71.7（C-4′），77.9（C-5′），62.8（C-6′），173.3（C-1″），44.1（C-2″），26.8（3″），22.6（4″）。以上数据与文献 ［4］ 一致， 故鉴定为patrinoside。

化合物2：黄色粉末（甲醇）。ESI-MS m／z：677［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：2.10（1H，d，J ＝16.8 Hz，H-2），2.47（1H，d，J ＝16.8 Hz，H-2），5.81（1H，quin，H-4），4.36（1H，m，H-9），1.21（3H，d，J ＝6.6 Hz，H-10），0.90（3H，s，H-11），0.91（3H，s，H-12），1.86（3H，d，J ＝1.2 Hz，H-13），4.28（3H，d，J ＝7.8 Hz，Glu-1′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：42.4（C-1），50.6 （C-2），201.1 （C-3），127.1 （C-4），167.2（C-5），79.9（C-6），131.5（C-7），135.2（C-8），77.2（C-9），21.1（C-10），23.4（C-11），24.6（C-12），19.5（C-13），102.7（C-1′），75.2（C-2′），78.1（C-3′），71.6（C-4′），77.9（C-5′），62.8（C-6′）。以上数据与文献［5］ 一致，故鉴定为roseoside Ⅱ。

化合物3：白色粉末（甲醇）。ESI-MS m／z：951［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：3.06（1H，dd，J ＝4.8 Hz，H-3），5.20（1H，brs，H-12），4.21（1H，d，J ＝8.4 Hz，H-Ara-1），4.29（1H，d，J ＝8.4 Hz，H-Glu-1′），5.30（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-Glu-1）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：39.8（C-1），27.0（C-2），90.7（C-3），40.1（C-4），57.0（C-5），19.3（C-6），33.9（C-7），40.7（C-8），49.0（C-9），37.9（C-10），24.5（C-11），123.8（C-12），144.8（C-13），42.8（C-14），28.9（C-15），24.0（C-16），49.0（C-17），41.8（C-18），41.4（C-19），36.7（C-20），29.2（C-21），32.4（C-22），28.5（C-23），16.9（C-24），16.1（C-25），17.8（C-26），26.3（C-27），178.0（C-28），74.3（C-29），107.1（C-Ara-1），78.1（C-Ara-2），72.8（C-Ara-3），69.5（C-Ara-4），66.3（CAra-5），95.7（C-Glu-1），73.8（C-Glu-2），78.0（C-Glu-3）， 70.9 （C-Glu-4）， 78.0 （C-Glu-5），69.5（C-Glu-6），104.6（C-Glu-1′），75.4（C-Glu-2′），78.0（C-Glu-3′），71.5（C-Glu-4′），77.8（CGlu-5′），62.7（C-Glu-6′）。以上数据与文献［6］一致，故鉴定为（3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl-（1 →6） -β-D-glucopyranoside。

化合物4：黄色晶体（DMSO）。ESI-MS m／z：455［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：7.95（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2′，6′），6.93（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3′，5′），6.82（1H，s，H-3），5.06（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-Glu-1），3.76（1H，s，H-Glu-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：182.0（C-4），164.2（C-7），162.9（C-2），161.4（C-4′），161.1（C-9），156.9（C-5），128.6（C-2′，C-6′），121.0（C-1′），116.0 （C-3′， C-5′），105.3 （C-10），103.1（C-3），99.9（C-Glu-1），99.5（C-6），94.8（C-8），77.2（C-Glu-3），76.4（C-Glu-5），73.1（C-Glu-2），69.5（C-Glu-4），60.6（C-Glu-6）。以上数据与文献［7］ 一致，故鉴定为apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物5：白色针晶（DMSO）。ESI-MS m／z：483［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：5.00（1H，m，H-10），4.78（1H，s，H-10），4.58（1H，s，H-1″），4.35（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-3），4.23（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-1′），2.42（1H，t，J ＝5.4 Hz，H-1），2.28（1H，m，H-7），1.63（1H，d，J ＝9.6 Hz，H-7），2.12（1H，m，H-4），1.95（1H，overlap，H-4），1.23（3H，s，H-8），0.61（3H，s，H-9）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：150.8（C-2），113.4（C-10），101.1（C-1′），100.9（C-1″），76.6（C-3′），75.2（C-5′），73.3（C-2′），71.8（C-3），70.7（C-4′），70.5（C-3″），70.3（2″），68.3（C-5″），67.2（C-6′），50.0（C-1），40.3（C-6），39.9（C-5），31.9（C-4），26.8（C-7），25.8（C-8），21.9（C-9），17.9（C-6″）。以上数据与文献［8］ 一致，故鉴定为fissoside B。

化合物6：黄色晶体（DMSO）。ESI-MS m／z：577［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：1.07（3H，d，J ＝6.0 Hz，H-6‴），4.54（1H，d，J ＝6.0 Hz，H-1‴），5.06（1H，d，J ＝7.2 Hz，H-1″），6.44（1H，s，H-6），6.76（1H，s，H-8），6.85（1H，s，H-3），6.95（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3′，H-5′），7.95（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2′，H-6′），10.37（1H，s，4′-OH），12.95（1H，s，5′-OH）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：17.8（C-6‴），66.0（C-6″），68.3（C-5‴），69.5（C-2‴），70.3（C-3‴），70.7（C-4″），72.0（C-2″），73.1（C-4‴），75.6（C-3″），76.3（C-5″），94.8（C-8），99.5（C-6），99.9（C-1‴），100.5（C-1″），103.1（C-3），105.4（C-10），116.1（C-3′），121.0（C-1′），128.6（C-2′，C-6′），156.9（C-9），161.2（C-4′），161.3（C-7），162.9（C-5），164.4（C-2），182.0（C-4）。以上数据与文献 ［9］ 一 致， 故 鉴 定 为 芹 菜 素-7-O-β-D-芦 丁糖苷。

化合物7：黄色晶体（甲醇）。ESI-MS m／z：807［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：3.83（3H，s，H-7），5.01（1H，d，J ＝7.8 Hz，H-1″），6.29（1H，d，J ＝7.2 Hz，H-6），6.55（1H，s，H-8），6.83（2H，d，J ＝9.0 Hz，H-3′，H-5′），8.07（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2′，H-6′）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD） δ：179.7 （C-4），167.4 （C-7），162.7（C-5），161.8（C-4′），159.7（C-9），158.5（C-2），135.9（C-3），132.6（C-2′，C-6′），122.5（C-1′），116.2（C-3′），106.5（C-10），105.5（C-1″），104.0（C-1″″），101.9（C-1‴），99.2（C-6），93.3（C-8），79.6（C-4‴），75.4（C-5″），75.0（C-3″），74.0（C-4″″），73.2（C-3″″），73.0（C-2″″），72.2（C-2″），72.1（C-3‴），71.9（C-2‴），70.2（C-5″″），70.0（C-5‴，C-4″），67.6（C-6″），56.6（C-OMe），18.0（C-6″″），18.0（C-6‴）。以上数据与文献 ［10］ 一致， 故鉴定为rhamnocitrin 3-O-［ α-L-rhamnopyranosyl （ l → 4 ） -O-α-Lrhamnopyranosyl（1→6） ］ -β-D-galactopyranoside。

4 活性测试

4.1 细胞培养 将细胞从液氮罐中取出，常规方法［11-12］复苏，将细胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640 培养液，在37 ℃，5%CO2饱和湿度条件下培养。根据不同细胞的生长速度1 ～2 d 更换新鲜的培养液或者传代。

4.2 CCK-8 检测 将处于对数生长期的HL-60、K562 细胞制成密度9×104／mL、8×104／mL 的细胞悬液接种于96 孔板中，每孔100 μL，每组设置5个平行孔。在培养箱中培养24 h 后分别加入不同质量浓度的化合物1 ～6（从低到高依次为0、20、40、60、80、 100 μg／mL） 及 阳 性 对 照 品 顺 铂50 μL。给药后继续在培养箱中培养48 h，取出培养板，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。1～2 h（K562 1.5 h，HL-60 2 h） 后在450 nm 处测OD 值。并计算细胞抑制率及IC50值。

4.3 对白血病细胞增殖抑制活性测定 各化合物的IC50值见表1。据相关文献报道［13］，单体化合物的IC50＜100 μg／mL，表明实验样品具有明显的细胞毒活性。结果显示，化合物1～3、5 ～6 对HL-60细胞具有一定的毒性抑制作用，化合物2 ～6 对K562 细胞具有一定的毒性抑制作用。

5 讨论

异叶败酱是墓头回最早的药源植物［14］，是历代本草中以墓头回使用的主流，但是关于异叶败酱的化学成分报道却很少，目前国内外有12 个三萜类、5 个环烯醚萜酯、3 个木脂素、2 个甾体类、3个黄酮类、1 个多糖和1 个香豆素类化合物的报道。异叶败酱总皂苷和粗制剂可用于治疗急慢性白血病、子宫癌、宫颈癌和大肠癌［15］，但是其发挥药效的确切化合物尚未确定。本研究从异叶败酱中分离得到7 个化合物，其中化合物1 为环烯醚萜类、化合物2 为单环降倍半萜苷类、化合物3 为三萜皂苷类、化合物5 为单萜类龙脑苷、化合物4、6～7 为黄酮类。通过CCK-8 法筛选了化合物1 ～6对HL-60 和K562 细胞的增殖抑制作用。结果显示，各单体化合物对白血病细胞具有一定的毒性抑制作用，且化合物1 ～3、5 ～6 对HL-60 细胞、化合物2～6 对K562 细胞的抑制作用与药物质量浓度有一定的依赖关系，以期为今后进一步研究异叶败酱的抗白血病作用提供参考。虽然单体化合物对白血病细胞表现出了体外毒性，但中药成分复杂，异叶败酱化学成分抗白血病作用的确切机制还需进一步研究。

表1 各化合物抗白血病细胞IC50值（μg／mL）Tab.1 IC50 values of various compounds on leukemia cells（μg／mL）