基质匹配溶剂校准-GC-MS/MS法测定卷烟主流烟气B[a]P

廖惠云，王 瑞，张 华，吴 洋，曹 毅，张 媛，王晨辉

江苏中烟工业有限责任公司,南京市建邺区兴隆大街29 号 210019

苯并［a］芘（B［a］P）是行业关注的卷烟烟气7 种代表性有害成分之一［1-5］。在量化分析烟气B［a］P过程中，由于复杂烟气成分带来的干扰，加之目标物在烟气中的释放量处于纳克级的水平，特别是低焦油卷烟烟气中目标物的释放量可能更低。因此，如何有效去除卷烟烟气复杂基质的干扰，快速、准确测定其中的B［a］P 是烟气分析研究的热点［6-8］。

相较于现行国标GB/T 21130—2007［9］的方法，有不少科研工作者对其量化分析进行优化研究，比如周仕禄等［10］、史佳沁等［11］、边照阳等［12］、尉朝等［13］、王春兰等［14］、段沅杏等［15］、陈晓水等［16］、王晶等［17］、申钦鹏等［18］先后对样品前处理过程或质谱仪器进行改进完善，以期达到简化样品前处理、提高分析准确度的目的。其中为了提高操作效率，采用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）方法，将样品萃取液直接进样分析成为一种技术选择，但实际验证结果表明，受基质效应影响,目标物的回收率偏低。客观说来，这些分析方法对于大批量样品的快速、准确测定仍有待完善之处。因此，在参考相关文献［19-21］的基础上，建立了采用基质匹配溶剂配制标准溶液，样品萃取溶液直接进样，使用GC-MS/MS 测定卷烟主流烟气B［a］P 释放量的方法，旨在为卷烟烟气中痕量B［a］P 的定量分析提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

18 个不同盒标焦油量的市售卷烟（其中1#～5#样品为细支卷烟，6#～18#样品为常规圆周卷烟）；卷烟烟气分析用1#标准样品。

环己烷、甲醇、二氯甲烷（色谱纯，德国CNW公司）；氘代苯并［a］芘（B［a］P-d12）、苯并［a］芘（标准品，≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；500 mg/6 mL 硅胶固相萃取柱（上海安谱科学仪器有限公司）。

6890N/5975C 气相色谱-质谱联用仪、7890A/7000B 气相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪（美国Agilent 公司）；RM 20H 全自动吸烟机（德国Borgwaldt KC 公司）；HY-5A 回旋振荡器（常州国华电器有限公司）；KQ-500DE 超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；R-215 旋转蒸发仪（瑞士Büchi 公司）；T201 电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准工作溶液的配制

（1）内标溶液和标准储备液

准确称取内标物B［a］P-d12，使用环己烷为溶剂配制浓度为320 ng/mL 的内标溶液；准确称取目标物B［a］P，使用环己烷为溶剂配制浓度为200 ng/mL 的标准储备液。

（2）基质匹配溶剂

按GB/T 19609—2004［22］的要求收集20 支卷烟烟气分析用1#标准样品的烟气总粒相物，添加40 mL 环己烷，于振荡器上160 r/min 条件下萃取40 min，静置片刻，得萃取液。在对萃取液进行处理前，先对固相萃取柱进行活化，即用5 mL 甲醇进行淋洗，排干，再用10 mL 环己烷平衡，柱子筛板上保留少量环己烷。然后用活化好的固相萃取柱制备基质匹配溶剂，即准确移取10 mL 萃取液至活化好的固相萃取柱，待萃取液全部移至固相萃取柱的填料后，先用环己烷分3 次、每次10 mL 进行淋洗，再用二氯甲烷分3 次、每次10 mL 进行淋洗，弃去淋洗液；最后用10 mL 甲醇进行洗脱，收集洗脱液，视为基质匹配溶剂。

（3）标准工作溶液

分别准确移取标准储备液50、100、200、500 和1 000 μL，以及内标溶液各250 μL，用基质匹配溶剂稀释定容至10 mL 容量瓶中。该系列标准工作溶液B［a］P 浓度分别为1、2、4、10 和20 ng/mL，其中内标B［a］P-d12浓度为8 ng/mL。

1.2.2 样品处理与分析

按照GB/T 16450—2004［23］的要求收集20 支卷烟的总粒相物。将收集有20 支卷烟总粒相物的玻璃纤维滤片放入100 mL 锥形瓶中（滤片应整片放入锥形瓶内铺平，不能剪碎或撕碎），准确移入1 mL 内标溶液于滤片上，并移入40 mL 环己烷，置于振荡器上于160 r/min 条件下萃取40 min，静置片刻。将萃取液过0.45 μm 有机相滤膜，将滤液直接进行GC-MS/MS 分析。分析条件为：

色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；进样量：2 μL；进样方式：脉冲不分流进样，进样压力172.37 kPa，持续时间0.75 min；载气：氦气，恒流速度1.2 mL/min；程序升温℃（20 min）；传输线温度：280 ℃；电离方式：EI 源，正离子模式；离子源温度：300 ℃；四极杆温度：均为180 ℃；碰撞气：氮气，流速1.5 mL/min，载气（氦气）流速2.25 mL/min；多反应监测（MRM）模式，详细参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 基质匹配溶剂制备考察

前期验证实验表明，使用环己烷作配标溶剂、应用GC-MS/MS 分析B［a］P 时，受基质效应影响，烟气中目标物的回收率偏低。因此，基质效应是采用MS 法分析烟气中B［a］P 时必须考虑的问题。基质效应通常不能被消除，但一般可采用SPE净化、稀释样品提取液、采用合适的内标、标准加入法以及配制基质匹配标准溶液等［24］措施来减小其对量化分析的影响。对比现行国标方法［9］采取的措施，本着简化样品前处理过程的目的，本研究中采用配制基质匹配标准溶液的方法来减小基质效应的影响，具体思路为：使用硅胶固相萃取柱净化样品溶液时，上样液和淋洗液经接收合并、浓缩后用于MS 分析，而样品溶液中其余物质被吸附保留在固相萃取柱中，理论上被视为干扰基质。在尽可能与样品溶液中目标物存在的基质环境保持一致情况下，该部分物质经洗脱下来，再经稀释后制成基质匹配溶剂，用于配制基质匹配标准溶液。

表1 目标物的MRM 参数Tab.1 MRM parameters of B［a］P and B［a］P-d12

图1 不同淋洗条件下B［a］P 的提取离子对色谱图Fig.1 Ion-pairs chromatograms of B［a］P under different eluent volume conditions

为此，先行考察B［a］P 在硅胶固相萃取柱的保留行为，以期制备合适的基质匹配溶剂。具体过程为：按照1.2 节的方法，参照GB/T 21130—2007［9］的方法加入30 mL 环己烷进行淋洗，收集淋洗液并浓缩至1 mL，溶液中目标物的色谱图见图1a；再用二氯甲烷分4 次、每次10 mL 进行淋洗，分别收集淋洗液并浓缩至1 mL，溶液中目标物色谱图见图1b～图1e。色谱图1a～图1e 中B［a］P 的峰面积依次为319 715、5 114、2 488、1 486 和0（因色谱图1e中目标物的S/N 小于10，视为未检出），可见使用30 mL 环己烷和30 mL 二氯甲烷才能使目标物被完全洗脱。理论上，B［a］P 的辛醇-水分配系数lg KOW为6.04，属于非极性化合物，在硅胶固相萃取柱中是不易保留的。实际检测结果表明，用环己烷淋洗后，B［a］P 在柱子中仍有少许保留。所以在制备基质匹配溶剂时，依次用30 mL 环己烷、30 mL 二氯甲烷为溶剂淋洗萃取液，弃去淋洗液，最后直接用10 mL 甲醇洗脱，收集全部洗脱液，视为基质匹配溶剂，用于配制标准工作溶液。

2.2 仪器条件优化

2.2.1 进样方式优选

基于烟气中B［a］P 释放水平及其在萃取液中的稀释程度，为提高响应情况，在痕量分析中可加大进样量来提高灵敏度。一般来讲，溶剂在衬管内气化后有较大膨胀体积，普通压力下进样有体积限制。为此可使用脉冲模式，用以提高实际进入色谱柱的样品量，使气化后的样品更多进入色谱柱进而提高检测灵敏度；同时由于本方法中采用了脉冲进样，使得进样口压力变大，在溶剂膨胀体积和衬管体积允许条件下，将进样量由通常的1 μL 改为2 μL。在保持其他条件不变的情况下，研究进样方式对目标物响应的影响。图2a～图2d 依次为分流（分流比为10∶1）、脉冲分流（分流比为10∶1）、不分流及脉冲不分流等进样方式下目标物出峰情况。可以看出，4 种进样方式下，B［a］P 出峰情况总体较好，峰形对称，基线完全分离。相比于分流条件而言，不分流条件下目标物峰面积更大，同时信噪比也有一定程度提高。在不分流条件下，相比单纯不分流而言，脉冲不分流条件下的目标物峰面积、信噪比均显著提高。因此，考虑目标物整体出峰状况，优选脉冲不分流为色谱进样方式。

图2 进样方式对B［a］P 出峰情况的影响Fig.2 Effect of injection mode on chromatogram peak of B［a］P

2.2.2 离子对及碰撞能量的确定

图3 全扫描模式下B［a］P（a）和B［a］P-d12（b）的质谱图Fig.3 Mass spectra of B［a］P（a）and B［a］P-d12（b）under full scan mode

以高浓度标准工作溶液为对象，通过全扫描模式选择合适的母离子，B［a］P 和B［a］P-d12的质谱图如图3 所示。可以看出，B［a］P 分子离子（也就是其基峰离子）为m/z 252，B［a］P-d12分子离子（也就是其基峰离子）为m/z 264。因此，分别选择m/z 252 和m/z 264 为B［a］P 和B［a］P-d12的母离子。进一步分析，由于B［a］P 极性很小、结构非常稳定，不同碰撞能量产生的质谱图差异较大，因此在5～60 eV 碰撞能量范围条件下，采用产物离子扫描模式进行检测，以此优选产物离子及其碰撞能量。结果显示：碰撞能量小于30 eV 时，相对于母离子丰度，B［a］P 产生碎片离子的丰度均小于其10%；碰撞能量大于30 eV 时，B［a］P 母离子产生碎片离子丰度显著增大，特别是碰撞能量大于40 eV 时，母离子更大程度被打碎，产生的基峰离子为m/z 250。综合考虑各离子响应情况，确定B［a］P 的定量离子为m/z 250，辅助定性离子为m/z 226，各自优化的碰撞能量分别为50 eV 和30 eV。同理，可确定B［a］P-d12定量离子为m/z 260，辅助定性离子为m/z 236，各自优化的碰撞能量分别为50 eV 和40 eV。

2.2.3 质谱温度参数优选

考虑到最低基质配标工作溶液中B［a］P 浓度仅为1 ng/mL，当质谱仪器离子源和四极杆为常用温度时，目标物响应值低且峰形不好，对B［a］P的定量分析有一定影响。为此，以1 ng/mL 最低标样溶液为对象，探讨高离子源和四极杆温度（分别为300、180 ℃）以及常用温度条件下目标物出峰情况，具体结果见图4 和图5。可以看出，相比于常用温度质谱参数，高温质谱参数下B［a］P 和B［a］P-d12的背景信号稍微有所增加，但目标物峰形总体情况更好，峰形对称且不拖尾，信噪比提高，响应信号增强。综合考虑质谱仪器离子源温度极限值，兼顾离子源使用寿命以及定量分析结果的准确性，优选离子源和四极杆温度分别为300 ℃和180 ℃。

2.3 样品前处理优化

2.3.1 萃取液处理过程优选

图4 不同质谱温度条件下B［a］P 的提取离子对色谱图Fig.4 Ion-pairs chromatograms of B［a］P at different mass temperatures

图5 不同质谱温度条件下B［a］P-d12的提取离子对色谱图Fig.5 Ion-pairs chromatograms of B［a］P-d12 at different mass temperatures

对于卷烟主流烟气B［a］P 的分析而言，因其释放量较低，需经过富集和分离等过程，易对检测结果带来影响。基于此，充分利用GC-MS/MS 仪器MRM 采集模式下复杂基质中目标物响应灵敏的特点，直接采用萃取溶液进行仪器分析，得到的典型样品溶液色谱图如图6a 所示。可以看出，B［a］P 峰形对称，能够与基线完全分离，基线噪声趋近于零，杂质干扰峰较少。采用现行国标方法［9］得到的色谱图（图6b），B［a］P 峰形对称，能够与基线完全分离，但是基线噪声较大，杂质干扰峰较多，信噪比相较本方法更低。由此可见，在采用GC-MS/MS 法分析时，即使直接使用萃取液进样，目标物依然能够精确定量，并且整体出峰情况优于现行国标方法。更为重要的是，样品前处理大为简便，无需对萃取液进行净化、浓缩等过程，节省了有机溶剂。

图6 不同前处理条件下B［a］P 的总离子流色谱图Fig.6 TIC chromatogram of B［a］P under different sample processing conditions

2.3.2 提取方式选择

按照现行国标方法［9］进行B［a］P 分析，采用超声萃取进行提取时，随提取时间的延长，超声波发生器内水温升高，受环己烷沸点低的影响，锥行瓶内气相压力增大，给前处理操作带来负面影响。为此，以15#卷烟样品为对象，使用GC-MS/MS 方法，将萃取溶液直接进样检测分析，比较了超声和振荡两种萃取方法对检测结果的影响，结果见表2。可以看出，随萃取时间的延长，两种萃取方式对B［a］P 检测结果影响的变化趋势较为一致，即先逐渐增大，到40～50 min 左右趋于峰值。综合考量检测结果和操作效率，选择提取方式为振荡萃取，萃取时间为40 min。

表2 萃取方式对B［a］P 检测结果的影响Tab.2 Influence of extraction method on results of B［a］P detection （ng·支-1）

2.4 方法学考察

将系列标准溶液进行GC-MS/MS 分析，求得线性回归方程及其相关参数。回归方程为Y=1.56X-0.010，决定系数R2为0.999 6，目标物在1.04～20.8 ng/mL 浓度范围内呈线性关系。以基质配标得到的最低浓度标样为对象，平行测定9 次，求其标准偏差；分别以3 倍和10 倍标准偏差对应的结果为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），计算得LOD 和LOQ 分别为0.14 ng/支和0.46 ng/支，结果显示本方法比现行国标方法［9］更为灵敏。

分别以不同盒标焦油量的1#和6#卷烟样品为对象，依次进行日内精密度和日间精密度实验，计算6 次平行测定结果的相对标准偏差（RSD），结果如表3 所示。可以看出，本方法的日内RSD 介于3.13%～3.80%之间，日间RSD 介于5.41%～6.94%之间。在含有目标物的玻璃纤维滤片中分别加入低、中、高3 个水平的标准溶液，进行加标回收实验，结果见表4。可以看出，低、中、高3 个水平的加标回收率在94.62%～104.81%之间。本方法具有较好的精密度和准确度，能够满足烟气中痕量目标物的定量分析。

表3 方法的精密度Tab.3 Precision of the method

表4 方法的回收率Tab.4 Recoveries of the method

2.5 与现行国标方法的比较

分别采用本方法和现行国标方法测定了18 个不同盒标焦油量的细支和常规卷烟样品主流烟气B［a］P 释放量，结果见表5。可以看出，相比于现行国标方法，本方法检测结果的相对偏差均在±10%以内。采用SPSS 软件对两种方法的测定结果进行配对t 检验，结果表明，选取置信度为95%时，Sig.=0.216（＞0.05），说明两种方法的测定结果不存在显著性差异。由此可见，对于痕量目标物的定量分析而言，两种方法的一致性较好。

表5 不同盒标主流烟气焦油释放量卷烟样品的实际检测结果Tab.5 Determination results of cigarette samples with different labeled tar levels from mainstream smoke

3 结论

①采用样品萃取溶液直接进样方式，建立了基质匹配曲线-GC-MS/MS 法快速测定卷烟主流烟气B［a］P 的方法，回收率为94.62%～104.81%，RSD 介于3.13%～6.94%之间，检出限为0.14 ng/支，定量限为0.46 ng/支。②样品对比分析表明，本方法与现行国标方法的测定结果基本一致。③本方法具有操作简便、耗费溶剂少、灵敏度高等优点，为准确、快速测定卷烟主流烟气B［a］P 释放量提供了新方法。