基于拔尖人才培养的生物化学综合性实验设计

赵玉红, 张 伟, 戴若辰, 马铭阳, 魏奇澜,蒋沛恩, 孙雨萱, 李 欣, 赵立青

(南开大学 生物国家级实验教学示范中心，天津 300071)

0 引 言

2009年，我校入选教育部第一批“基础学科拔尖学生培养试验计划”，成立伯苓班。作为生物学科拔尖人才培养试点班的生物伯苓班，每年经严格选拔，招生约25人。生物学是实验性很强的学科，因此学生科研能力的训练是拔尖学生培养的重要环节[1]。

生物化学实验作为生物学实验类专业课程的先导课，是学生从事其他生命科学研究的重要基础[2-3]。为在生物化学实验教学中培养伯苓班学生的科研能力，进一步激发他们的创新潜能，在小班授课、单人操作的基础上，通过教学-科研相结合的方式，由科研实验室提供部分具有探究性质的课题内容，作为综合性实验项目，面向伯苓班同学开放选修。

蛋白质是一种重要的生物大分子，解析其三维结构有利于阐述其功能。为了研究某蛋白的三维结构，某科研实验室将目的蛋白基因进行外源高效表达，经纯化获得高浓度、高纯度的目的蛋白，然后筛选合适的目的蛋白晶体，对其进行结构解析。但在具体实验过程中，发现蛋白晶体质量不高。高纯度、高浓度的蛋白样品是获得高质量蛋白晶体的重要前提，考虑到在使用原核表达系统表达重组融合蛋白时，不同的诱导条件对于蛋白的表达影响很大，优化诱导表达条件十分必要[4]，因此在生物化学实验教学中，设计“目的蛋白最佳诱导表达条件的确定及其纯化”综合性实验项目，对伯苓班学生进行科研训练，旨在提高学生科研能力，取得了很好的教学效果。

1 实验仪器

AKTA prime plus蛋白纯化系统、Amicon浓缩桶、nanodrop 2000超微量紫外分光光度计、超低温培养箱、恒温摇床、凝胶成像仪等。

2 实验材料与试剂

实验材料：大肠杆菌BL21(DE3)(含某重组蛋白，由科研实验室提供)。

试剂：Tris，咪唑，NaCl，SDS，甘氨酸，TEMED，AP，考马斯亮蓝R250，低分子量蛋白Marker，冰乙酸，IPTG，氨苄青霉素等。

预装柱：镍柱(HisTrapTMHP)，凝胶过滤层析柱(HiPrepTM16/60 SephacrylTMS-200 HR)，离子交换柱(HiTrapTMDEAE FF)。

3 实验方法

3.1 目的蛋白最佳诱导表达条件的确定

(1) 菌种的培养。将含目的蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)诱导活化，以1%的接菌量接种于50 mL LB(含100 μg/mL Amp)培养基中，继续扩大培养，作为测定目的蛋白最佳诱导表达条件的实验用菌种。

(2) 目的蛋白诱导表达。将上述实验用菌种，以1%的接菌量，分别接种于9瓶100 mL LB培养基，37 ℃ ，200 r/min，培养至OD值在0.6～0.8之间。分别添加IPTG，至终浓度分别为100、300、500 μmol/L。分别以16、28、37 ℃振荡培养，于不同时间取样500 μL，12 000 r/min，离心1 min，弃上清，-20 ℃冻存。其中16 ℃和28 ℃培养的取样时间为：8、10、12、13.5、14、20、22 h；37 ℃培养的取样时间为：3、4、5、6、7 h。诱导前设不加IPTG的阴性对照。

(3) SDS-PAGE电泳检测。将菌体沉淀用200 μL buffer(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0)充分悬浮后，加入等体积的2×蛋白loading，混匀，煮沸5 min。12 000 r/min，离心5 min，取样15 μL，以5%浓缩胶和12%分离胶进行SDS-PAGE电泳检测，确定目的蛋白最佳诱导表达条件。

3.2 目的蛋白诱导表达及其纯化

3.2.1 目的蛋白诱导表达

按3.1(1)对菌种进行活化、扩大培养，以1%接菌量接种到1 L的LB培养基中，以最佳诱导条件对目的蛋白进行诱导表达。4 ℃，8 000 r/min，离心10 min，收集菌体，-20 ℃冻存。

3.2.2 菌体超声破碎

用40 mL Ni柱结合缓冲液buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH8.0)充分悬浮菌体沉淀后，菌悬液冰上预冷，超声破碎。程序：功率180 W，超声5 s，间歇6 s，直至菌液清亮。超声破碎后，4 ℃，13 000 r/min，离心40 min，收集上清，作为蛋白样品粗提液。

3.2.3 目的蛋白纯化

(1) Ni亲和层析。用Ni亲和层析柱对蛋白样品粗提液进行初步纯化。程序：① buffer A平衡His TrapTMHP柱至基线平稳；② B泵上样，buffer A冲洗Ni柱至UV值不再变化；③ 用洗脱缓冲液buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，1 mol/L咪唑，pH 8.0)和buffer A形成咪唑梯度(180 mL，B：0%～30%)，洗脱目的蛋白。2 mL/管收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测。收集目的蛋白液，浓缩桶浓缩至约1 mL。

(2) 离子交换层析。将浓缩的样品以1∶100的比例用buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)进行稀释，进一步经阴离子交换柱进行纯化。程序：① buffer A平衡HiTrapTMDEAE FF柱至基线平稳；② B泵上样，buffer A冲洗直至UV值不再变化；③ 用洗脱缓冲液buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl， pH 8.0)和buffer A形成盐离子梯度(60 mL，B：0～100%)，洗脱目的蛋白。1 mL/管收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测。收集目的蛋白液，浓缩桶浓缩至5 mL以下。

(3) 凝胶过滤层析。浓缩后的样品进一步经凝胶过滤层析纯化。流动相：buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)、buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 8.0)。程序：① 以15%buffer B平衡HiPrepTM16/60 SephacrylTMS-200 HR一个柱体积；② 15%buffer B洗脱。1.5 mL/管收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测。收集目的蛋白液。

3.2.4 蛋白浓度检测

将纯化好的目的蛋白液浓缩至1～2 mL，用nano drop 2000超微量分光光度计检测蛋白浓度，分装，-80 ℃冻存。

4 结果与分析

4.1 蛋白最佳诱导表达条件的筛选

分别对IPTG不同诱导浓度、不同诱导温度、不同诱导时间培养的菌种取样，进行SDS-PAGE电泳检测(见图1)。实验结果表明，在加入IPTG作为诱导剂时，蛋白Marker 43kDa下方产生1条特异性蛋白条带，与目的蛋白大小(41 kDa)相一致。由于不同的胶染色、脱色程度不同，难以准确判断蛋白最佳诱导表达条件。为进一步提高实验结果的可靠性，将图1中8块胶上蛋白表达量相对较高的几个样品，再次进行SDS-PAGE电泳检测(见图2)。结果表明，目的蛋白最佳诱导表达条件为：诱导温度16 ℃，IPTG浓度300 mmol/L，诱导时间20 h。

(a),(b),(c)：温度为16 ℃条件下，IPTG浓度分别为100、300、500 mmol/L，诱导时间分别为8、10、12、13.5、20、22 h时的目的蛋白表达; (d),(e),(f)：温度为28 ℃条件下，IPTG浓度分别为100、300、500 mmol/L，诱导时间分别为8、10、12、13.5、20、22 h时的目的蛋白表达; (g),(h)：温度为37 ℃条件下，IPTG浓度分别为100、300、500 mmol/L，诱导时间分别为3、4、5、6、7 h时的目的蛋白表达

图1 IPTG不同诱导温度、不同诱导时间、不同诱导浓度条件下目的蛋白的表达

图2 筛选出15种不同IPTG诱导条件下目的蛋白的表达

4.2 Ni亲和层析及SDS-PAGE检测

目的蛋白N端带有His标签，能特异性的结合在Ni柱上。用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱，由于不同蛋白及杂质结合能力不同，因此通过此步可以获得初步纯化的目的蛋白。根据监测图(见图3)，紫外吸收从48管开始有升高迹象，在第51、52、53管达到峰值，到55管恢复到基线。于是对48、50、52、54和55管中的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测(见图4)。实验结果表明，镍柱亲和纯化效果较好，目的蛋白样品中存在少许杂蛋白；通过与Marker比较，目的蛋白分子量大小约为41 kDa，与理论值相符；第50～55管中的目的蛋白比较富集且纯度较高，收集这6管蛋白，浓缩至1 mL，待进一步纯化处理。

图3 Ni亲和层析监测图

图4 Ni柱亲和层析纯化得到的目的蛋白SDS-PAGE电泳结果

4.3 离子交换层析及SDS-PAGE检测

目的蛋白的等电点为5.03，在pH为8.0的缓冲液中带负电荷，故选用阴离子交换柱。根据监测图(见图5)，对32～38管中的蛋白样品进行浓缩，体积不大于5 mL。此步操作，由于学生时间关系，简化了SDS-PAGE电泳检测。实际上不应该省略此步，因为根据SDS-PAGE电泳检测结果进行蛋白样品收集，收集到的蛋白样品更加富集、纯度高，后续纯化效果更佳。

图5 阴离子交换层析监测图

4.4 凝胶过滤层析及SDS-PAGE检测

将上述浓缩的蛋白样品进一步经凝胶过滤层析纯化，从监测图(见图6)可以看出，出现两个紫外吸收峰。从出峰时间和峰面积大致判断后面的主峰应该是目的蛋白峰，前面的小峰可能是分子量较大的杂蛋白。取35、37、39、41和43管进行SDS-PAGE电泳检测(见图7)。结果显示，目的蛋白样品纯度很高，达到了分离纯化的目的。

图6 凝胶过滤层析监测图

图7 凝胶过滤层析纯化得到的目的蛋白SDS-PAGE电泳结果

4.5 蛋白浓缩及浓度检测

取凝胶过滤层析39、40、41这3个收集管中的蛋白样品，浓缩至约400 μL，用nano drop 2000检测蛋白浓度，浓度为54 mg/mL，表明1 L大肠杆菌最终得到了约21.6 mg的高纯度目的蛋白。

5 教学组织

(1) 实验进度安排。由于伯苓班同学在大二上半学期刚接触到生物化学基础理论知识和实验技能的学习，因此该综合性实验的开展安排在实验课中后期。此时学生理论课上学习了蛋白质、核酸等基本理论，实验课上学习了SDS-PAGE电泳、凝胶过滤层析、离心、分光光度等技术，具备了一定的生物化学基本理论和操作技能。作为基础实验课的一种拓展和提升，该综合性实验具有一定的探究性，需要学生付出一定的时间和精力进行钻研，因此安排实验课中后期约6周时间，学生可以充分利用业余时间或实验课上等待间隙，通过查阅文献资料或与教师探讨，了解实验目的和意义、提出解决方案、自主实验、完成成果展示等。

(2) 项目为开放性选修项目。为尊重伯苓班同学的个性化发展和学术志趣，与科研实验室紧密合作，开发了多项符合学生认知水平和操作能力的、具有一定探究性质的综合性实验项目，本项目只是其中之一。学生可根据自身兴趣，自由选题。为保证教学效果，项目人数控制在4或5人。学生以团队形式，自主制定实验计划和进度安排[5]，应用既有知识和技能解决实际问题。实验室则为学生积极营造鼓励独立思考、自由探索、勇于创新的开放式教学环境[6]。

(3) 研讨课。最后一次实验课结束后，进行综合性实验PPT展示。目的有两个：① 通过PPT制作，促进学生对实验进行分析、总结和反思，通过理论知识与实践知识相互融合，使学生对所学知识有着更加透彻的认知和理解[7]，并通过触类旁通，形成自己的知识体系；② 通过PPT展示，培养学生交流和表达能力，使学生能够清晰、科学地描述问题，准确表达观点，初步掌握学术交流能力[8]。且在研讨过程中，锻炼学生推理、应变、思辨的能力，提高综合素质。

6 教学效果

6.1 激发学生科研兴趣

该综合实验项目兼具两大优点：

(1) 实用性。学生需要利用已有的生物化学理论知识和实验技能储备，通过查阅相关文献资料，为科研实验室课题组获得高浓度、高纯度的蛋白样品提供可靠的最佳诱导条件。能够灵活运用所学知识帮助科研实验室解决实际问题，让学生很有成就感，大大激发了他们参与科研的兴趣。

(2) 挑战性。由于生物大分子样品需要95%或更高的纯度才易结晶，样品中的任何杂质都可能与大分子发生作用，影响晶体的生成[9]，因此要获得满足要求的、高质量的蛋白样品，对学生来讲，充满挑战。对于不愿意按部就班的伯苓班同学来讲，该项目充满吸引力，学生兴趣浓厚，整个实验过程中参与的积极性非常高。同时，该项目组同学的参与，也给其他同学带来了一定的“攀比压力”，伯苓班同学纷纷主动走进科研实验室，整个班级科研氛围浓厚。

6.2 培养学生科研能力

(1) 培养学生自学能力。由于项目来自于科研课题，实验开展过程中，没有教师的讲授、没有可参考的教材，学生必须通过自己查阅相关的文献资料或与教师探讨，才能对实验原理、实验设计思路和方法有比较深入、透彻的理解，这需要学生有较强的自学能力。且在不断地以理论指导实践，以实践检验理论的实验实践中，学生通过对知识不断进行归纳、总结、分析，自主建构知识体系的能力也得到培养。

(2) 掌握多项实验技能。本文的实验结果全部来自学生的实验结果，通过这些结果，发现学生实践动手能力尚存在一定的欠缺。通过该综合性实验，学生拥有了更多操作、实践的机会，譬如通过锻炼，学生的SDS-PAGE操作基本功越来越扎实。同时，学生通过实验，也学到了很多其他实验技能，如：无菌操作、蛋白诱导表达以及蛋白纯化系统里涉及的多项层析技术等。这些技能的获得，将有利于他们在科研实验室自主开展相关的课题研究，摆脱以往只能给师兄、师姐洗瓶子等打下手的窘境。

(3) 培养学生的创新意识。在该综合实验的实施过程中，遇到了很多实际问题。譬如对IPTG不同诱导温度、不同诱导浓度、不同诱导时间的菌体取样后，样品处理起初是菌体沉淀用50 μL buffer悬浮后，加入等体积的2×Protein SDS PAGE Loading Buffer，煮沸5 min。结果发现煮沸后的溶液太过黏稠，导致SDS-PAGE的上样量误差很大，结果不可靠。后来学生提出改进意见：① 加大体系的量；② 上样前进行离心。后经学生自己实验探索，效果很好，在后续实验中采用了学生改进的方法。整个实验围绕“获得高纯度、高得率的目的蛋白”展开，在解决实际问题的过程中，学生发现问题、分析问题、解决问题的能力得到不断锻炼。而问题解决的过程本就是一种创新，学生不断解决问题的过程就是创新意识培养的过程[10]。

(4) 启发学生思考，形成批判性思维。在PPT制作过程中，学生会对实验原理进行深究、对实验结果会进行深入的分析与讨论、对实验的整体设计思路进行回顾与总结，这无形中达到了启发学生思考的目的。此外，PPT展示结束，学生间、老师和学生间的问答，更是大大促进了学生思考和批判性思维的形成。譬如其他同学提问的问题有：① 初次养菌，发现疑似噬菌体感染，如何发现的？怎么解决菌种问题？② 从实验结果看，并不是IPTG浓度越高，蛋白诱导表达量越高，为什么？③ 不同的SDS-PAGE胶由于染色、脱色程度不一样，如何对不同的取样蛋白样品进行量化比较，从而选出最佳诱导条件？④ 应用蛋白纯化系统进行蛋白纯化时，为什么要对收集的蛋白样品进行浓缩，然后再进行下一步纯化？一个个问题的提出，点燃了同学间思想火花的碰撞，潜移默化中孕育创新的种子。

6.3 培养学生团队合作精神

为提高伯苓班实验课的教学效果，在授课方式上采取单人操作的方式，赋予学生更多自主探索的实践机会、便于师生互动，这也是目前拔尖人才培养实验教学中普遍采用的一种教学方式[11-13]。但是许多创新成果往往需要团队合作才能产生，因而也不可忽视学生团队合作意识、沟通能力以及组织能力的锻炼与培养。本文提出的综合性实验项目，需要伯苓班同学以小团队的形式，来完成实验目标。团队不指定负责人，形成“人人参与，人人负责”的团队运行模式。这对心气高的伯苓班同学来讲，如何以团队的力量来圆满完成这样一项具有自主、合作、探究性质的实验项目也是一种挑战。而实验项目有计划、有步骤的顺利进行,包括以团队形式进行的PPT展示，表明学生在分工合作过程中对团队合作精神有了重新的认识，沟通能力、组织能力也得到了很好的锻炼。

7 结 语

通过教学-科研紧密结合，课程组为学生设计了“目的蛋白最佳诱导表达条件的确定及其纯化”这个综合性实验项目，旨在教学实践中渗入科研的内容和方式，充分利用研究项目等科研资源来提高本科教育质量，促进学生的综合运用和创新能力[14]，并使学生实现自主学习并获得研究素质和能力[15]。经2016级伯苓班25位同学的实施，取得了很好的教学效果，同学们给予了高度评价。该综合性实验项目既体现学科发展前沿，又涉及多项生物化学基础实验知识和技能的综合运用，且具有一定的探究性和挑战性，适于作为训练拔尖人才科研能力的生物化学综合性实验项目，进行推广。同时，以科学研究促进教学进步，对于拔尖人才创新能力培养是一个很好的思路，值得借鉴和思考。