铝诱导的茶树根系转录组变化分析

黄丹娟，谭荣荣，陈勋，王红娟，龚自明，王友平，毛迎新*

铝诱导的茶树根系转录组变化分析

黄丹娟1，谭荣荣1，陈勋1，王红娟1，龚自明1，王友平2，毛迎新1*

1. 湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北 武汉 430064；2. 湖北省农业科学院植保土肥研究所，湖北 武汉 430064

探讨茶树响应铝（Aluminum，Al）的基因调控网络和表达模式，确定一些关键候选基因，为茶树耐Al分子机制研究奠定基础。测定了0、0.2、1、2、4 mmol·L-15个Al3+浓度处理7 d的福鼎大白茶根系抗氧化酶活性和Al含量变化，并提取0 mmol·L-1（R0）、1 mmol·L-1（R1）和4 mmol·L-1（R4）3个浓度下的茶树根系总RNA，通过Illumina Hiseq Xten平台进行高通量转录组测序。结果表明，随着Al3+浓度的升高，根系POD（Peroxidase，过氧化物酶）活性逐渐下降，APX（Ascorbic acid peroxidase，抗坏血酸过氧化物酶）活性则逐渐升高。SOD（Superoxide dismutase，超氧化物歧化酶）活性在Al3+浓度为1 mmol·L-1时最高，CAT（Catalase，过氧化氢酶）活性在各处理间无显著差异。根系中Al含量随着Al3+浓度的升高呈先上升后下降趋势，在Al3+浓度为1 mmol·L-1时达到最高。经筛选得到R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1的DEGs（Differentially expressed genes）分别为1 894、2 439个和1 384个，显著上调（下调）的差异表达基因分别有733（1 161）、846（1 593）个和628（756）个。GO富集分析表明，3个处理组在生物学途径中富集最多的类别均为刺激响应。在分子功能和细胞组件方面，R1 VS R0和R4 VS R0富集最多的类别均为核酸结合转录因子活性和细胞外围，R4 VS R1富集最多的类别为氧化还原酶活性相关基因和膜区域。KEGG富集分析表明，R1 VS R0、R4 VS R0、R4 VS R1分别显著富集了29、41条和19条Pathway，它们包括转录因子、转运蛋白、植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成途径等，鉴定到多个参与调控活性氧代谢、有机酸或金属转运蛋白、转录因子及细胞壁结构修饰等生理过程的基因在Al诱导后上调或抑制表达，显示这些基因与茶树耐Al分子机制密切相关。

茶树；Al；根系；差异表达基因；RNA测序

在中性或中等酸性土壤中，Al主要以不溶性沉积物的形式存在。但在酸性土壤（pH<5.0）中，Al以Al3+、Al(OH)2+和Al(OH)2+等形式被溶解释放到土壤溶液，从而抑制根系的生长，减少水分和养分的吸收，导致作物减产[1]。因此，Al毒是酸性土壤中作物产量的主要限制因素。茶树适宜生长在pH为4.5~5.5的酸性土壤中，作为一种Al超富集植物，其体内Al含量是其他植物的几十到几百倍，且不表现毒害症状，适宜浓度的Al能明显促进茶树生长[2-3]。

茶树的耐Al机制可分为外部排斥和内部耐受两种方式。首先，茶树根系可以分泌草酸、柠檬酸、苹果酸等低分子量有机酸，螯合过量的Al3+，进而减少与根表皮细胞壁和质膜上结合的Al3+数量[4-7]。其次，进入茶树体内的Al约70%沉积在细胞壁，并且根部细胞壁中73%的Al与果胶和半纤维素结合[8-9]。而进入原生质体中的Al有80%区隔化在液泡中，其余的以Al-儿茶素、AI-F、Al-草酸、Al-磷酸盐等稳定络合物贮存[10]。同时，从过量Al3+引起的损害中恢复则依靠的是对活性氧（ROS，reactive oxygen species）毒害的解除作用。过量Al3+引起植物代谢变化，产生的活性氧对生长组织造成损害，这种损伤诱导编码清除ROS酶（如谷胱甘肽转移酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶等）的基因转录，这些基因的过表达增强了植物对Al的耐受性[11]。以往对茶树耐Al机理的研究大多集中于生理生化层面，植物耐Al分子机理的研究主要集中在拟南芥[12-13]、水稻[14]、荞麦[15]、绣球花[16]等植物中，大量与Al响应相关候选基因被挖掘与鉴定，主要是转运蛋白、转录因子及与细胞壁修饰相关基因。如有机酸转运蛋白—Al激活苹果酸转运蛋白（Aluminum-activated malate transporter，）基因[17]、转运柠檬酸的多药和有毒化合物排出家族蛋白（Multidrug and toxinextrusion protein，）基因[18]、耐Al转录因子（Resistance transcription factor1，）[19]、调控Al胁迫基因表达的对低pH敏感转录因子（Sensitive to proton rhizotoxicity 1，）[20-21]，与细胞壁修饰相关的对Al根际毒害敏感基因（Sensitive to Al rhizotoxicity 1）和[22]，以及促进果胶分子的去酯化的果胶酯酶基因等。

高通量测序技术的发展，为从转录组水平阐明高等植物响应Al的基因表达网络，挖掘耐Al候选基因提供了全面、高效的手段。通过转录组、蛋白组和代谢组等技术手段揭示茶树耐Al的分子机理已有相关报道，部分候选基因和相关蛋白被相继鉴定出来。Xu等[23]采用iTRAQ蛋白质组学对茶树受Al3+胁迫下的叶片和根系的蛋白差异表达进行了研究，最终从根系和叶片中分别鉴定到755个和1 059个差异蛋白，根系中富集的上调表达蛋白多数参与糖酵解代谢而叶片中富集的上调表达蛋白多涉及光合作用；此外，抗氧化酶和柠檬酸盐合成相关蛋白也在根系中积累来响应Al3+胁迫。Li等[24]利用RNA-Seq技术分析了0、0.2、1 mmol·L-1Al3+浓度处理3 h后根系转录组变化，鉴定到一批涉及转运蛋白、转录因子、氧化应激通路蛋白，以及多糖和细胞壁代谢、能量和次级代谢、有机酸阴离子和酶分泌等差异表达基因，包括等。Zhao等[25]进一步分析了50个茶树品种基因序列，发现5个阿萨姆茶树品种中出现了9 bp碱基序列的缺失，推测基因中这9 bp碱基序列的变异可能与茶树Al富集相关。Fan等[26]探索了Al3+促进茶根系生长与养分吸收的机理，利用RNA-seq对0、0.4、4 mmol·L-1Al3+处理下的根系进行差异基因挖掘，聚类分析显示，一些参与细胞生长与分裂相关途径基因可能参与了不同Al供应下对根系生长的调控，参与K吸收的的表达与侧根中K含量呈正相关，预示着Al可能通过上调相关基因表达进而促进K离子的吸收和细胞的生长与分裂来促进茶树根系生长。宁秋燕[27]对Al3+处理下根尖细胞壁膨大与重组过程中的关键蛋白木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（）和伸展蛋白（）进行了表达分析，结果表明Al3+短期处理中和基因在根尖迅速上调表达，这可能对于Al3+促进茶树后期根系的显著性伸长、分生生长具有关键性作用。

茶树基因组的发表为进一步阐明茶树重要生命活动规律提供了坚实的基础。基于RNA-Seq鉴定不同Al3+水平调控的关键基因，是解析茶树Al耐受分子机理的重要手段。本研究利用RNA-seq技术构建了茶树无Al3+、适宜Al3+和高Al3+浓度处理下的根系转录组文库，鉴定茶树根系响应Al3+胁迫的应答基因，增加对茶树耐Al机制的认识，为进一步筛选茶树耐Al相关基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

供试材料为福鼎大白茶生长良好、大小一致的一年生扦插苗，茶苗由湖北大悟县半兵卫茶业有限公司提供。2018年3—8月，试验培养箱采用40.0 cm×30.0 cm×15.0 cm的蓝色不透明塑料箱，箱盖带有20个独立开孔，每孔放入1株茶苗，用海绵固定，培养室光照强度＞450 μmol·m-2；温度(22~25)℃，16 h光照/8 h黑暗，空气湿度65%~85%。先用纯蒸馏水预培养3 d。随后移至营养液中。营养液参照文献[3]的配方，用0.1 mol·L-1H2SO4或NaOH调pH至5.0，每隔7 d更换1次营养液并持续通气。待茶苗长出大量白色吸收根后用于后续Al处理。Al处理采用A12(SO4)3·18H2O，设置0、0.2、1、2、4 mmol·L-15个Al3+浓度，各组重复3次。处理7 d后，取每盆5株茶树幼根于液氮速冻，作为1个重复样，然后置于–80℃冰箱保存，备用。

1.2 抗氧化酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所的总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（可见光法）、过氧化物酶（POD）测定试剂盒（比色法）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）测试盒（紫外比色法），根据试剂盒提供的说明测定茶树根系总SOD、CAT、POD、APX 4种抗氧化酶活性，3次生物学重复。

1.3 Al含量测定

Al含量测定参考王敏等[3]方法。取液氮磨碎的鲜样0.4 g至玻璃消化管，依次加入5 mL HNO3与2 mL HClO4，盖上盖子，60℃预消煮2 h后，120℃消煮至消煮液无色澄清透明，冷却后，用双蒸水稀释至50 mL。取10 mL使用ICP-OES（电感耦合等离子体原子发射光谱法）测定Al元素的含量，每个处理3次生物学重复。标准曲线绘制：用1%稀硝酸将Al标准储备液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）逐级稀释为0、5、10、30、40、50 µg·mL-1，仪器自动绘制标准曲线。

1.4 总RNA提取、cDNA文库构建及转录组测序

每个处理3次生物学重复，每个生物学重复由5株茶树根系混合而成。采用改良的CTAB法[28]提取茶树根系总RNA，Nanodrop检测RNA浓度，1%的琼脂糖电泳检测RNA完整性，Labchip对RNA精确质检。质检合格后送武汉博越致和生物科技有限公司构建RNA-Seq文库，并在Illumina Hiseq Xten平台上进行测序。

1.5 数据质控及过滤

测序得到的原始图像数据文件经碱基识别（Base calling）分析转化为原始测序序列（Raw reads），结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列（Reads）的序列信息及其对应的测序质量信息。Raw reads经过滤去除接头序列和低质量序列得到获得纯净reads（Clean reads）。

1.6 参考序列比对分析

采用Hisat2软件，以茶树基因组[29]作为参考基因组，将clean reads比对到参考基因组序列，使用Hisat2软件，参考基因组选“C.sinensis.genome.fa”文件，注释文件选择“C.sinensis.gene.gtf”文件，对测序得到的reads比对情况做出评价。本研究所有基因注释ID都以茶树基因组基因ID表示。

1.7 差异表达基因的筛选和功能注释

采用FPKM值（Fragments per kilo bases per million mapped reads，代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数）来反映基因的表达量[30]。采用DESeq2表现基因的读段数在不同生物学个体之间的差异。在DESeq2的统计结果中，通过差异倍数[|log2(Fold change)|>1]和FDR（False discover rate）≤0.05为筛选条件，在3个转录组比较组合中（R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1）筛选差异表达基因。对找到的差异表达基因利用EggNOG数据库（http://eggnogdb.embl.de）和emapper工具进行GO注释，获得基因的Orthologous groups，然后用R语言的phyper函数进行超几何分布检验。以Q-value≤0.05为阈值定义差异表达基因中显著富集的GO terms。采用R语言的clusterProfiler包进行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，确定差异表达基因参与的代谢途径。

1.8 差异表达基因荧光定量PCR验证

2 结果与分析

2.1 抗氧化酶活性及Al含量变化

植物遭受逆境胁迫时体内产生活性氧，引起膜脂过氧化和膜系统损伤，而抗氧化酶可清除植物体内的活性氧，且不同酶对逆境有不同的响应。由图1可知，无Al3+时根系POD活性显著高于其他Al3+浓度下POD活性，且随着Al浓度的升高，根系POD活性逐渐下降。SOD活性在Al3+浓度为1 mmol·L-1时最高，其他处理无显著差异。APX活性随着Al3+浓度的增加逐渐升高。不同Al3+浓度处理下茶树根系CAT活性无显著差异。

由图2可知，在0~1 mmol·L-1Al3+浓度范围内，根系中Al含量随着Al3+浓度的升高呈上升趋势，在Al3+浓度为1 mmol·L-1时达到最高。当Al3+浓度为2 mmol·L-1和4 mmol·L-1时，Al含量均下降，但根系中Al含量仍高于0~0.2 mmol·L-1Al3+处理，表明高Al3+浓度对茶树根系造成了一定损伤，抑制了根系对Al3+的吸收。

表1 用于qRT-PCR表达验证的8个基因及其引物

注：FW表示鲜重，mgprot为毫克蛋白数；数据为3次重复的平均值±标准差（n=3）。柱形图上不同字母表示P<0.05，相同字母间无显著差异

注：数据为3 次重复的平均值± 标准差（ n=3 ）。折线图上不同字母表示P<0.05，相同字母间无显著差异

2.2 测序数据质量分析及差异基因筛选结果

测序原始数据碱基组成基本平衡，并且碱基百分比（Q30）大于92%。充分说明测序得到的数据质量可靠，可满足后续分析。9个样品共得到3 137.9万~4 292.6万对100 bp的reads，将包含测序接头和低质量reads去除后，得到1 984.2万~4 154.3万对clean reads，占原始序列的93.5%~98.0%。与茶树基因组进行基因序列比对，从比对结果来看（表2），R0、R1、R4平均分别有67%、69%和67%的reads能有效地比对到参考序列上，成功注释到参考基因的unique reads占总reads的比例依次为50.1%、47.0%和46.4%。

从基因表达水平分布图可以看出（图3-A），3个样品的表达水平相似，log10(FPKM+1)值主要集中在1左右。经筛选得到不同比较间（R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1）的DEGs（图3-B）。R1与R0的DEGs为1 894个，上、下调基因分别为733个和1 161个；R4与R0的DEGs为2 439个，上、下调基因分别为846个和1 593个；R4与R1的DEGs为1 384个，上、下调基因分别为628个和756个（图3-C）。R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1共有的差异表达基因为120个。

表2 不同Al浓度处理茶树根系转录组数据统计

2.3 差异表达基因的Gene Ontology富集分析

GO（Gene ontology）数据库可用于描述基因产物的功能。通过GO富集分析可以寻找与差异表达基因相关的主要特征功能分类。利用emapper工具对所有基因进行GO注释。结果表明，共有7 366条基因注释到其参与的生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及细胞组分（Cellular Component，CC）三大功能分支条目上，揭示茶树响应不同浓度Al3+相关基因的多样性。GO富集分析结果表明（图4），在生物学途径中，R1 VS R0有606个DEGs（占总DEGs的32.0%）被注释，涉及基因数目较多的条目依次是刺激响应（358个，占59.1%）、胁迫响应（229个，占37.8%）、化学响应（209个，占34.5%）、非生物胁迫响应等3个生物学过程；R4 VS R0中有1 168个DEGs（占总DEGs的47.9%）被注释，其中富集最多的类别与R1 VS R0相同；R4 VS R1中有408个DEGs（占总DEGs的47.5%）被注释，富集最多的类别同样是刺激响应（225个，占比55.1%）。

在分子功能方面，R1 VS R0有429个基因（占总差异基因的42.5%）被注释，主要富集在核酸结合转录因子活性（109个，占比25.4%）中；R4 VS R0共有551个DEGs（占总DEGs的22.6%）被注释，其中富集最多的也是核酸结合转录因子活性（127个，占23.0%）。R4 VS R1共有301个DEGs（占总DEGs的21.7%）被注释，富集最多的类别是氧化还原酶活性相关基因（45个，占比15.0%）。

在细胞组件方面，R1 VS R0有804个DEGs（占总DEGs的22.7%）被注释，涉及到细胞壁、液泡、细胞膜、细胞质等几乎所有细胞组分。其中，富集差异基因数目较多的分别是细胞外围（310个，占比38.6%）、细胞外区域（124个，占比15.2%）、细胞壁（122个，占比15.2%）、外部封装结构（122个，占比15.2%）、质外体（74个，占比9.2%）等细胞组件。R4 VS R0共有1 025个DEGs（占总DEGs的42.0%）被注释，其中富集最多的前6个基因类别有5个与R1 VS R0相同，此外还包括细胞质膜（272个，占比26.5%）。R4 VS R1有579个DEGs（占总DEGs的41.8%）被注释，其中富集最多的基因类别是膜（290个，占比50.1%），其次为细胞外区域、细胞壁、外部封装结构、质外体等。

图3 R0、R1、R4 3个样本基因表达水平分布图（A）、差异表达基因的交集分析（B）和上、下调差异表达基因个数（C）

注：1：刺激响应；2：胁迫响应；3：化学响应；4：非生物胁迫响应；5：有机物响应；6：激素响应；7：氧化还原过程；8：脱水响应；9：对水分的响应；10：次级代谢过程；11：细胞外围；12：细胞外区域；13：细胞壁；14：外部封装结构；15：质外体；16：植物型细胞壁；17：膜；18：细胞质膜；19：类囊体；20：转录因子活性，序列特异性DNA结合；21：核酸结合转录因子活性；22：羧酸酯水解酶活性；23：果胶酯酶活性；24：木葡聚糖:低聚木糖葡糖基转移酶活性；25：氧化磷酸化解耦活性；26：转移酶活性，转移己糖基；27：水解酶活性，水解O-糖基化合物；28：水解酶活性，作用于糖基键；29：转移酶活性，转移烷基或芳基（甲基除外）基团；30：氧化还原酶活性；31：氧化还原酶活性，作用于CH-OH供体；32：氧化还原酶活性，作用于以NAD或NADP为受体的CH-OH供体组；33：酒精脱氢酶（NADP+）活性；34：醛酮还原酶（NADP）活性；35：谷胱甘肽转移酶活性

2.4 差异表达基因的KEGG富集分析

利用KEGG数据库对筛选出的DEGs进行了功能分类和Pathway注释。结果表明，R1 VS R0有634个DEGs（占总DEGs的33.5%）可以详细注释到KEGG数据库中337条代谢通路中，R4 VS R0有810个DEGs（占总DEGs的33.3%）注释到KEGG数据库中344条代谢通路中，R4 VS R1有505个DEGs（占总DEGs的36.5%）注释到KEGG数据库中316条代谢通路中。R1 VS R0、R4 VS R0、R4 VS R1分别显著富集了29、41、19条Pathway。由表3可知，R1 VS R0显著富集的Pathway中注释到转录因子中的基因最多（53个，占8.4%），其次是植物-病原菌互作途径（48个，占7.6%）、苯丙烷生物合成途径（39个，占6.2%）、细胞色素P450途径（35个，占5.5%）、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化途径（25个，占3.9%）等。R4 VS R0和R4 VS R1富集最多的Pathway均为转运蛋白（109个和60个，占比13.5%和11.9%），此外，R4 VS R0显著富集到了转录因子相关基因，R4 VS R1则富集到了与苯丙烷生物合成途径和参与光合作用的蛋白等相关基因。

2.5 抗氧化酶相关基因

以无Al3+处理（R0）为对照，本研究在R1中分离到了8个上调表达的抗氧化酶基因（7个和1个）和15个下调表达的抗氧化酶基因（9个和6个）；在R4中分离到了31个抗氧化酶基因，其中5个上调表达（4个和1个），26个下调表达（13个、12个和1个）。表明随着Al3+浓度的提高，抗氧化酶基因多呈下调表达趋势，特别是，这与本研究测定的POD活性变化相一致。

表3 KEGG显著富集的前5条代谢通路

2.6 转运蛋白与转录因子相关基因

植物对Al3+的吸收和解毒是一个复杂精密的过程，其中，转运蛋白参与了吸收转运、螯合、区隔化和代谢利用等调控过程，发挥着关键作用。从茶树根系中鉴定出了许多与细胞转运有关的差异表达基因，包括编码苹果酸转运蛋白编码基因，柠檬酸转运蛋白编码基因，ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters），金属离子转运蛋白（如镁转运蛋白、锌转运蛋白、铜转运蛋白），硝酸、磷酸和硫酸盐转运蛋白，铵转运蛋白，氨基酸转运蛋白，水通道蛋白等相关基因。以无Al3+处理（R0）为对照，在R1和R4处理组中分别鉴定到6个（4个上调，2个下调）和9个（6个上调，3个下调）ABC转运蛋白基因，表明ABC转运蛋白基因在茶树根中的表达随着Al3+浓度的提高而上调。在R1和R4中分别鉴定到1个MATE家族蛋白基因，均为下调表达。此外，在R1中鉴定到1个下调表达的硫酸盐转运蛋白基因，在R4样本中鉴定出2个上调表达和1个下调表达的硫酸盐转运基因、1个下调表达的亚硫酸盐外排基因TauE/SafE。R4处理组中还发现4个水通道蛋白基因（1个上调，3个下调），以及4个硝酸盐转运蛋白基因、3个氨基酸转运蛋白基因、1个磷酸盐转运蛋白基因、1个镁转运蛋白基因、1个锌转运蛋白基因、1个钾转运蛋白基因，均为下调表达。高Al3+浓度（R4）与适宜Al3+浓度（R1）处理组间相比，鉴定得到与苹果酸分泌有关的1个在R4处理的茶树根系中显著上调表达，而R1处理时的表达量比无铝处理时有所下降，表明可能参与Al3+诱导的茶树根苹果酸分泌；还鉴定到了7个ABC转运蛋白基因（2个上调，5个下调），2个硫酸盐转运蛋白基因（1个上调，1个下调），2个下调的硝酸盐转运蛋白基因和2个下调的铵转运蛋白基因，1个上调的铜转运蛋白基因和1个下调的镁转运蛋白基因，1个上调表达的水通道蛋白基因等。

植物在响应生物和非生物胁迫时，大量转录因子被诱导表达，以应对环境刺激。本研究在茶树根中鉴定了多种类型的转录因子，包括WRKY、MYB、BZip、热休克因子、乙烯响应转录因子等。以无Al3+处理（R0）为对照，在R1和R4处理中分别鉴定到9个和12个WRKY转录因子、1个乙烯响应转录因子、2个gata转录因子、1个BZip转录因子，均下调表达；鉴定得到1个热休克因子在R1中下调表达，在R4中则上调表达；此外，在R1中鉴定到1个上调表达的STOP1转录因子；在R4中鉴定到2个MYB转录因子，1个下调表达，1个上调表达。高Al3+浓度（R4）与适宜Al3+浓度（R1）处理组间相比，在茶树根中鉴定到2个下调表达的，表明茶树中的不受高Al3+浓度诱导；4个WRKY转录因子，其中3个上调表达，1个下调表达，还检测到1个下调表达的MYB转录因子。

2.7 细胞壁形成与修饰相关基因

Al3+胁迫下，植物细胞壁的属性、组分及与细胞壁相关联的酶和基因都会受到影响。以无Al3+处理（R0）为对照，本研究在R1和R4样本中分别鉴定到1个上调表达的胼胝质合成酶（Callose synthase）基因，6个（2个上调表达，4个下调表达）和10个（3个上调表达，7个下调表达）纤维素合酶及其类似蛋白（Cellulose synthase/-like protein）基因，17个（14个上调，3个下调）和12个（9个上调，3个下调）果胶酯酶（Pectinesterase，PEs）基因，以及8个木葡聚糖内切水解酶（Xyloglucan endo-hydrolase，XEH）基因和3个木葡聚糖内转糖基酶（Xyloglucan endo-transglycosylase，XET）基因，在R1和R4样本中均下调表达。高Al3+浓度（R4）与适宜Al3+浓度（R1）处理组间相比，鉴定到2个上调表达的胼胝质合成酶基因，2个上调表达的果胶裂解酶基因，1个上调表达的木葡聚糖内转糖基酶基因，8个果胶酯酶基因（2个上调，6个下调）和2个纤维素合酶（1个上调，1个下调）基因。

2.8 差异表达基因的 qRT-PCR 荧光定量分析

为了验证RNA-Seq结果的可靠性，随机挑选了8个基因进行qRT-PCR表达分析。结果表明，8个基因的表达变化趋势与RNA-Seq结果（图5）较为一致，证明转录组测序数据具有较高的可重复性和准确性。

3 讨论

本研究应用RNA-Seq技术对茶树无Al3+（0 mmol·L-1，R0）、适宜Al3+（1 mmol·L-1，R1）和高Al3+（4 mmol·L-1，R4）浓度处理下的根系转录组进行了比较分析，获得了大量差异表达基因。GO功能富集分析显示这些差异表达基因所参与的生物学过程主要包括刺激和胁迫响应、氧化还原反应等过程。差异表达基因的分子功能主要包括核酸结合转录因子、果胶酯酶、氧化还原以及物质转运等功能。差异表达基因的Pathway显著性富集分析进一步表明差异基因广泛涉及转录因子、转运蛋白、植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成等生物学路径。

在茶树中，Mukhopadyay等[32]研究表明，在0~0.4 mmol·L-1Al3+范围内，随Al3+浓度的升高，茶树品种T-78根系SOD、POD、CAT、APX活性均显著提高；当Al3+浓度超过胁迫点4 mmol·L-1时，这些酶活性迅速降低。本研究中，根系SOD和APX表现出相似的趋势，这与Li等[33]研究结果一致；但POD活性随着Al3+浓度的升高逐渐下降，CAT活性则无显著差异，这可能与不同品种的耐Al性的遗传差异性有关。Al3+还能诱发多个抗氧化酶基因的表达来降低ROS的产生，促使植物从ROS诱导的损伤中恢复[34-35]。例如，过表达谷胱甘肽S-转移酶基因和POD基因，增强了转基因拟南芥植株对Al3+胁迫的耐受性[36]。本研究中，在茶树中检测到的抗氧化酶基因主要是和，在不同的Al3+浓度下，两基因的表达量存在显著差异，这与李勇[37]的研究结果相似，表明这两种抗氧化酶基因在茶树耐铝中发挥重要作用。

注：A：谷氨酰胺合成酶；B：黄烷酮3-羟化酶；C：生长素响应蛋白；D：果胶酶；E：植物果胶甲酯酶抑制；F：植物果胶甲酯酶抑制家族蛋白DC；G：水通道蛋白；H：谷胱甘肽S-转移酶

本试验筛选出的转运蛋白和转录因子种类，与Al3+处理的大豆[38]和柑橘[39]根中的研究结果相似，表明这些基因对于铝的解毒机制可能具有类似的作用机理，茶树可能具有与这些物种相似的一些耐Al机制。植物ABC转运蛋白能与外源有毒物质相结合，将其从细胞质基质中转运进液泡，以达到解毒的作用，减少对植物细胞的损害[40]。例如，水稻Al转运蛋白可将质外体中的Al清除，并在ABC-转运蛋白的协同作用下将Al区隔化到液泡中，从而达到解Al毒的目的[41]。本研究筛选到多个ABC转运蛋白受不同Al3+浓度诱导上调表达，Li等[24]对Al3+处理后嘉茗1号实生幼苗根尖转录组测序结果获得最多的转运蛋白也为ABC转运蛋白家族基因，说明这些基因可能参与茶树体内Al的区隔化。有研究表明，硫（Sulphur，S）可缓解小麦[42]、大麦[43]和柑橘[44]中的Al毒害。高Al3+浓度下，茶树根系硫酸盐转运基因上调表达，亚硫酸盐外排基因TauE/SafE则下调表达，表明Al3+胁迫下根可能通过增加S的吸收，减少S的输出，从而提高细胞S水平，缓解Al3+毒害，这些S转运有关的基因可能在茶树耐Al性中起作用。此外，还有金属离子转运蛋白（如镁转运蛋白、锌转运蛋白、铜转运蛋白）、硝酸和磷酸转运蛋白、铵转运蛋白、氨基酸转运蛋白等基因，也在茶树根系中发现其表达量存在显著差异，这些基因可能通过影响相应的金属离子、氨基酸和渗透物质等的转运，调节和维持细胞稳态。水通道蛋白（Aquaporin）可运输如NH3、尿素等小分子基团。Negishi等[45]在铝富集植物绣球花中鉴定到了2个分别位于液泡膜和细胞质膜上的水通道蛋白基因，它们具有转运Al3+功能。Li等[24]在高铝/适宜铝处理组中筛选到3个水通道蛋白，其中2个下调表达，1个上调表达。本研究在R4与R1的处理组中筛选到1个下调表达的水通道蛋白，推测其在茶树中也具有跨膜转运铝的作用，从而影响茶树对铝的富集作用。

本试验筛选出的部分转录因子，其调控模式和功能已在模式作物拟南芥和水稻中有了深入分析。例如，编码1个C2H2型锌指蛋白转录因子，调控质子和Al胁迫/耐性基因的表达[18,20]。本研究鉴定到的在R1 VS R0处理组间上调表达，而在R4 VS R1处理组则出现下调表达，表明茶树中的不受高Al3+浓度诱导。已有的研究表明，可能只是调控下游耐Al基因的关键转录因子，再由这些转录因子来诱导下游基因的表达，两者协同作用共同调控耐Al基因的表达，因而，在转录水平不受Al3+诱导[46]。植物中的WRKY转录因子在各种非生物胁迫中发挥重要作用，包括Al3+胁迫[47]。拟南芥中也鉴定到多个WRKY转录因子受Al3+诱导表达上调或下调[48-49]。Ding等[50]研究表明在拟南芥中被Al3+抑制，并负调节的表达。本研究在不同Al3+浓度处理下鉴定到的WRKY转录因子均下调表达，表明Al3+处理抑制了茶树根系中WRKY转录因子的表达。

植物抵御不良环境胁迫时，胼胝质在细胞壁与细胞膜之间沉积，可维持或保护细胞壁和质膜的正常功能。Al3+诱导的根胼胝质合成是耐Al性评价的重要指标[51]。不同Al3+处理浓度下，胼胝质合成酶（Callose synthase）基因均上调表达，表明Al3+促进了茶树根系胼胝质合成。此外，鉴定到纤维素合酶及其类似蛋白以下调表达居多。Al3+诱导的纤维素合酶的下调也与茶树根胼胝质合成酶上调表达结果相呼应，因为Al3+诱导的纤维素合成抑制有利于胼胝质的合成[52]。果胶是植物细胞壁的重要组成成分，Al3+可与细胞壁果胶相互作用，导致细胞壁硬化，使根细胞伸长受到抑制[53]。果胶酯酶催化果胶的去酯化和脱乙酰化，促使细胞壁松弛，从而补偿Al引起的细胞壁硬化。与R0相比，R1和R4中果胶酯酶基因多上调表达，这些基因的表达上调可能有助于提高其耐Al性，缓解高浓度Al引起的根伸长抑制。木葡聚糖是双子叶植物初生细胞壁最丰富的半纤维素多糖，木葡聚糖内源转糖基酶/水解酶（Xyloglucan endo-transglucosylase/hydrolase， XTH）通过催化木葡聚糖的内转糖基化，或通过催化木葡聚糖的水解，从而促进细胞壁松弛[54-55]。本研究从茶树根中鉴定到8个和3个，在R1和R4处理中均下调表达。宁秋燕[27]分析了和在不同Al3+浓度处理下龙井43和白叶1号两个茶树品种中的表达差异，结果表明，Al3+处理7 d后，龙井43根系表达量在0.4、1 mmol·L-1和4 mmol·L-1均下调表达，则在1 mmol·L-1时表达下调，本研究与其结果类似。Yang等[56]研究表明Al3+处理后拟南芥根XET活性的明显降低可能是导致Al3+胁迫下拟南芥根伸长受抑制的原因，同时Al3+诱导的XET活性受抑制和肼胝质在拟南芥根中的累积是同步的。本研究中茶树根系下调表达与胼胝质合酶的上调表达也是同步的，与其结果类似。

本研究通过转录组分析，获得了茶树根在无Al3+（0 mmol·L-1，R0）、适宜Al3+（1 mmol·L-1，R1）和高Al3+（4 mmol·L-1，R4）3个Al3+浓度处理下的基因表达谱数据，鉴定到参与Al3+诱导茶树生理调控的活性氧代谢、转运蛋白、转录因子和细胞壁组分与修饰等多个相关基因，为解析茶树Al耐受分子机理研究提供了重要基因信息。

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Transcriptome Analysis of Root Induced by Aluminum in Tea Plants ()

HUANG Danjuan1, TAN Rongrong1, CHEN Xun1, WANG Hongjuan1, GONG Ziming1, WANG Youping2, MAO Yingxin1*

1. Institute of Fruit and Tea, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China;2. Institute of Plant Protection, Soil and Fertilizers, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China

The aim of this study was to investigate the gene regulation network and expression pattern of the response to aluminum (Al) in tea plants, and to identify the key candidate genes for understanding molecular mechanism of Al tolerance in tea plants. The roots’ antioxidant enzyme activities and Al content of Fuding Dabaicha cultivar were detected under 0 mmol·L-1, 0.2 mmol·L-1, 1 mmol·L-1, 2 mmol·L-1and 4 mmol·L-1Al3+concentrations for 7 d. The total RNA of roots under 0 mmol·L-1(R0), 1 mmol·L-1(R1) and 4 mmol·L-1(R4) Al3+concentrations were extracted for high-through transcriptome sequencing by Illumina Hiseq Xten platform. The results showed that with the increase of Al concentration, POD activity decreased while APX activity increased gradually. SOD activity reached the highest peak at the Al concentration of 1 mmol·L-1. However, CAT activity showed no significant difference among five treatments. The Al content first increased and then decreased with the increase of Al3+concentration, and reached the highest peak at the Al3+concentration of 1 mmol·L-1.The DEGs of R1 VS R0, R4 VS R0, R4 VS R1 were 1 894, 2 439 and 1 384 respectively with 733 (1 161), 846 (1 593) and 628 (756) DEGs significantly up-regulated (down-regulated). GO enrichment analysis shows that the most enrichment biological pathway of three samples were all stimulus responses. In terms of molecular function and cell components, R1 VS R0 and R4 VS R0 were mostly enriched in nucleic acid binding transcription factor activity and cell periphery, while R4 vs R1 were mostly enriched in redox enzyme activity and membrane. KEGG enrichment analysis illustrates that they were significantly enriched in 29, 41, and 19 pathways, respectively, including transcription factors, transporters, plant-pathogen interactions, and phenylpropanoid biosynthesis pathways. It was found that genes involved in physiological processes such as reactive oxygen metabolism, organic acids or metal transporters, transcription factors and cell wall structure modification were up-regulated or inhibited after Al induction, suggesting that these genes were closely related to the molecular mechanism of Al tolerance in tea plants.

, aluminum, root, differential expressed genes, RNA sequencing

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)05-506-15

2019-05-21

2019-06-28

国家重点研发计划（2016YFD0200900）、中央引导地方科技发展专项（2018ZYYD009）、湖北省农科院青年科学基金（2018NKYJJ15）、国家茶叶产业技术体系（CARS-19）、湖北省农业科技创新中心团队（2016-620-000-001-032）

黄丹娟，女，助理研究员，主要从事茶树栽培生理研究，E-mail: huangdjtea@163.com。*通信作者：maoyingxin@126.com