高效液相色谱法测定罗汉松种子挥发油中川芎嗪含量*

林乐珍，赵凯丽，杜 坤，黄增琼

（广西医科大学药学院，广西 南宁 530021）

罗汉松实为罗汉松科植物罗汉松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don 和短叶罗汉松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki Endl.的种子和花托［1］。罗汉松实具有治心胃痛、血虚面色萎黄、大补元气的功效［2］，主要含降二萜内酯类及萜类化合物［3-6］、生物碱类化合物［7］、黄酮类化合物［8］及多糖类、氨基酸、矿物元素和维生素［9］等；其提取物具有调节血脂、抗氧化、保肝和抗肿瘤等药理作用［10-12］。本课题组的前期研究发现，产于北海的罗汉松种子挥发油中含有大量的川芎嗪，其在挥发油中的相对百分含量高达 97.27%［7］。本研究中建立了罗汉松种子挥发油中川芎嗪的含量测定方法，为建立罗汉松实药材质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；电子天平，XS-205DU型天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司，十万分之一）；KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CD-UPH-Ⅱ-20T型超纯水器（成都超纯科技有限公司）；万能粉碎机（无锡久平仪器有限公司）。

1.2 试药

罗汉松种子鲜品采自广西北海，经广西医科大学药学院生药学教研室李琼讲师鉴定为罗汉松科植物短叶罗汉松P.macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki Endl.的种子；川芎嗪对照品（上海雅吉生物科技有限公司，批号为16072405）；甲醇为色谱纯，磷酸、石油醚（30～60℃）和无水硫酸钠均为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取川芎嗪对照品约20 mg，精密称定，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，得质量浓度为0.7572 g/L的对照品贮备液，精密移取2.0 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得质量浓度为0.06058 g/L的川芎嗪对照品溶液。取自然风干的罗汉松种子，粉碎，过20目筛，称取100g置圆底烧瓶中，加入1000 mL蒸馏水浸泡12 h后，保持微沸蒸馏6 h。馏出液用石油醚萃取3次，每次50 mL，合并醚层，加入无水硫酸钠脱水，50℃减压回收溶剂，得有芳香气味的淡黄色液体，即为挥发油；取挥发油约100 mg，精密称定，加甲醇超声溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。以甲醇为阴性对照溶液。

图1 高效液相色谱图

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：GL Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（60 ∶40，V/V），等度洗脱；流速：0.8 mL/min；检测波长：298 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。分别精密吸取 2.1 项下 3 种溶液进样测定。在此色谱条件下，理论板数以川芎嗪峰计大于20000，分离度大于1.5。色谱图见图1。

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取对照品贮备液0.005，0.010，0.020，0.040，0.050，0.100，0.200，0.300 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释，摇匀，定容，即得系列对照品溶液。按2.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以川芎嗪进样质量浓度（X）为横坐标、相对应的峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=82.182X+11.538，r=0.9998（n=8）。结果表明，川芎嗪进样质量浓度在0.38～22.72 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.1项下对照品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次，测定川芎嗪的峰面积。结果的RSD为0.32%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取挥发油样品6份，每份约100 mg，精密称定，依法制备供试品溶液，并按2.2项下色谱条件进样测定。结果川芎嗪平均含量为117.17 μg/g，RSD为1.60%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.1项下供试品溶液，室温放置0，2，4，8，12，24 h 时，按 2.2 项下色谱条件测定。结果的RSD为0.50%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的挥发油6份，精密称定，分别置容量瓶中，各精密加入一定质量的川芎嗪对照品，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定含量，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取罗汉松实挥发油3份，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定。结果 3 份样品含量分别为 118.35，117.72，116.62 μg/g，平均 117.56 μg/g。

表1 川芎嗪加样回收试验结果（n=6）

3 讨论

本研究中采用水蒸气蒸馏法对罗汉松种子进行提取，得淡黄色的挥发油，提取率为0.18%。在提取挥发油的过程中发现，将种子浸泡一段时间再蒸馏，可提高挥发油的提取率。考察了沸程为30～60℃和60～90℃石油醚对萃取效果的影响，结果2种石油醚的萃取效果相当。此外，萃取剂用量为被萃取液体积的1/2，萃取次数3次时，可获得最佳萃取效果。

经紫外扫描发现，川芎嗪在298 nm波长处有较强吸收，故选择298 nm作为测定波长。在加样回收试验中，对照品的加入量对测定结果的准确性有影响。选择川芎嗪含量较高的挥发油样品，加入较大量的对照品，可获得理想的测定结果。经测定，产于北海的罗汉松种子挥发油中川芎嗪含量为117.56 μg/g，种子中川芎嗪的含量为 0.212 μg/g。

罗汉松种子中含有川芎嗪，而川芎嗪已广泛用于冠状动脉粥样硬化性心脏病和缺血性脑病的治疗［13-14］，故建议将川芎嗪作为罗汉松实药材质量评价指标成分之一。本研究中建立了罗汉松种子中川芎嗪含量测定方法，操作简单，结果准确，分离度和重复性均良好，可用于罗汉松实药材的质量控制。