响应面法优化金线草黄酮提取工艺的研究

李燕，郭兴峰，张华，王玥科，刘嘉康

（聊城大学农学院，山东聊城252059）

金线草（Rubia membranacea）是茜草科茜草属下的一个植物种，作为传统中草药，可治疗疼痛、活血散瘀，祛风除湿[1]。其主要化学成分为黄酮类化合物、植物甾醇类、香豆素、脂类等[2]，其中最丰富的是黄酮类化合物，如3-O-β-D-吡喃半乳糖苷-鼠李黄素、3-O-β-D-吡喃半乳糖苷-槲皮素和木犀草素[3]。

黄酮类化合物（flavonoid），别名生物类黄酮，广泛存在于自然界中，约1/4 的植物中含有黄酮。黄酮类化合物具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、降血脂、去病强身、改善血液循环、抗凝血、降低心脑血管疾病，延年益寿及抑制肿瘤发生、增殖和迁移的功效[4-6]，同时黄酮对金葡萄球菌、甲乙型链球菌、流感杆菌等具有很强的杀灭能力，能治疗感冒、上呼吸道感染、急慢性气管炎、支气管炎、肺炎等疾病，因此黄酮类化合物对防治疾病以及人的健康有积极意义[7]。因黄酮易溶于有机溶剂，本试验选取乙醇回流提取法提取金线草中的黄酮，分别考察乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比4 个因素对提取效果的影响，在单因素试验的基础上，采用响应面优化试验设计对金线草黄酮提取工艺进行处理，得到金线草黄酮提取的最适宜工艺条件。本研究为金线草黄酮开发提供了一定的理论依据，为更好地利用金线草资源奠定了良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

金线草：湖南溪江；芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；石油醚（AR）、丙酮（AR）、无水乙醇（AR）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平（FA2004）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；高速中药粉碎机（QE-200）：武义县屹立工具有限公司；紫外分光光度计（UV-1800）：上海美谱达仪器有限公司；水浴锅（SB-2000）：上海爱朗仪器有限公司；低速离心机（TD5）：长沙英泰仪器有限公司；恒温摇床（TS-100B）：上海天呈实验仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金线草黄酮提取工艺流程

金线草→粉碎→按照一定比例加入石油醚→抽滤→取滤渣→乙醇溶液回流提取→抽滤→定容→测定提取液中黄酮吸光度

1.2.2 标准曲线的绘制

精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品37.5 mg置于100 mL 烧杯中，溶于60%乙醇溶液，混合均匀后定容至25 mL 容量瓶中，摇匀，即为配置完成的浓度为1.5 mg/mL 芦丁标准溶液。精密移取上述标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL 摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL 摇匀，放置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，再用70%乙醇溶液稀释至刻度，静置15 min 后，分别在510 nm 处测定其吸光度[8]。以芦丁标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到标准品溶液浓度（X，mg/mL）与吸光度（Y）的线性回归方程 Y=11.464X+0.014 1（R2=0.991 4），见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.3 金线草黄酮提取率的测定

金线草黄酮的提取率采用公式（1）计算：

式中：C 为提取液中黄酮的浓度，mg/mL；V 为提取液的最终体积，mL；M 为金线草样品的质量，g。

1.2.4 单因素试验

以金线草黄酮提取率为指标，分别考察乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比的影响。

1.2.5 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，建立了四因素三水平响应面分析因素与水平表，如表1 所示。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 结果分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对金线草黄酮提取率的影响

准确称取5 份质量为3.00 g 金线草粉末，分别置于锥形瓶中，按照料液比为1 ∶15（g/mL）的比例，依次加入60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液，在30 ℃下提取30 min，测定滤液中黄酮的吸光度，按照公式（1）计算金线草黄酮的提取率，结果如图2 所示。

图2 乙醇浓度对金线草黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由图2 可以看出，乙醇浓度由60%提高至70%，金线草黄酮提取率明显升高，在乙醇浓度为70%时达到最大值；当乙醇浓度超过70%，提取率逐渐降低。这可能是因为金线草黄酮类化合物种类繁多，且不同种类黄酮类化合物物理性质不同的原因，即醇溶性和水溶性的差异[9]。水溶性黄酮类化合物浸出率因乙醇浓度的增加逐渐降低，与此同时，一些醇溶性杂质和亲脂类成分溶出，达到一定限度后与黄酮竞争，同乙醇水分子结合，从而导致提取率下降。从节能和降低成本角度考虑，选取乙醇浓度70%为宜。

2.1.2 提取温度对金线草黄酮提取率的影响

准确称取5 份质量为3.00 g 金线草粉末，分别置于锥形瓶中，按照料液比为 1 ∶15（g/mL）的比例，加入70%的乙醇溶液，提取温度分别为 20、30、40、50、60 ℃，提取时间为30 min，测定滤液中黄酮的吸光度，按照公式（1）计算金线草黄酮的提取率，结果如图3 所示。

图3 提取温度对金线草黄酮提取率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由图 3 可知，在10 ℃～30 ℃范围内，金线草黄酮提取率与提取温度呈正相关；提取温度在30 ℃时黄酮提取率达到峰值；当提取温度超过30 ℃时，提取率与温度呈负相关。这是因为在一定温度范围内，温度升高加快了分子运动的速度，溶解速度也随之加快，同时高温也可以引起细胞膜结构变化，使黄酮类化合物由外层细胞转移到溶剂中[10]。所以随着温度升高，黄酮提取率逐渐升高，但是持续高温会使某些黄酮化合物的结构造到破坏，致使提取率下降。因此，提取温度以30 ℃为宜。

2.1.3 提取时间对金线草黄酮提取率的影响

准确称取5 份质量为3.00 g 金线草粉末，分别置于锥形瓶中，按照料液比为1 ∶15（g/mL）的比例，加入70%的乙醇溶液，提取温度为30 ℃，分别提取10、20、30、40、50 min，测定滤液中黄酮的吸光度，按照公式（1）计算金线草黄酮的提取率，结果如图4 所示。

图4 提取时间对金线草黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

由图4 可以看出，随着提取时间延长，金线草黄酮提取率不断升高；提取时间为30 min，黄酮提取率达到最高点；随着提取时间进一步延长，金线草黄酮提取率开始下降。其中可能的原因是提取时间一旦过长，金线草中黄酮化合物被氧化，以及溶剂挥发损失，造成金线草黄酮提取率下降。由此可得，金线草黄酮最适宜提取时间为30 min。

2.1.4 料液比对金线草黄酮提取率的影响

准确称取5 份质量为3.00 g 金线草粉末，分别置于锥形瓶中，依次按照 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1 ∶30（g/mL）的料液比，加入70%的乙醇溶液，在30 ℃下提取30 min，测定滤液中黄酮的吸光度，按照公式（1）计算金线草黄酮的提取率，结果如图5 所示。

图5 料液比对金线草黄酮提取率的影响Fig.5 The effect of solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由图5 可知，当料液比小于 1 ∶25（g/mL）时，金线草黄酮提取率呈上升趋势；料液比在1 ∶25（g/mL）时金线草黄酮提取率达到最高；当料液比大于1 ∶25（g/mL）时，提取率反而下降。一般而言，细胞内外金线草黄酮的浓度梯度在很大程度上取决于溶剂的用量，溶剂用量越大，细胞内外金线草黄酮的浓度梯度越大，黄酮与溶液的接触面积增大，在溶液中扩散程度提高，有利于细胞内黄酮类物质的逸出。但当溶剂用量过大时，原料中的杂质（如可溶性的多糖、蛋白质、果胶）溶出，这些杂质可能吸附黄酮或者是与黄酮结合[11]，因而使得黄酮提取率不升反降。所以从提高工作效率以及节约能源的角度考虑，料液比取1 ∶25（g/mL）为宜。

2.2 金线草黄酮提取工艺优化

2.2.1 响应面试验结果

为了得到乙醇回流提取金线草黄酮的最佳工艺条件，根据表1 中响应面分析因素和水平，以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取温度（D）作为自变量，以金线草黄酮提取率为响应值，应用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面回归拟合，试验设计与结果见表2。

表2 响应面优化试验设计与结果Table 2 The results of response surface analysis

续表2 响应面优化试验设计与结果Continue table 2 The results of response surface analysis

由表2 可得，试验设计总共29 组，其中零点试验5 组，析因试验 24 组。

2.2.2 回归方程的建立及显著性检验

利用Design Expert8.0.6 软件对该响应面进行分析，得四元二次回归模型方程如下：

回归分析结果见表3。表中P 值可以表示回归方程中各变量对响应值影响的显著性，且相应变量的显著程度与P 值呈负相关，即P 值越小，该变量的显著性越来越高。

表3 响应面回归分析结果Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance table

由表3 可以看出，该模型达极显著水平，失拟项不显著，说明此模型与实际情况拟合度较好。一次项乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取温度（D）对模型影响均达到极显著水平（P＜0.01）；交互项CD（料液比和提取温度）交互作用显著（P＜0.05）；各因素二次项 A2、B2、C2、D2的影响均达到极显著水平 （P＜0.01），从而进一步说明了各因素对响应面的影响不是单纯的线性关系。比较各因素对金线草黄酮提取率的影响程度，由大到小顺序依次为提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。

结合回归数学模型分析，对上述二次回归方程求解，可得到最佳提取工艺条件：温度39.86 ℃、时间40.31 min、乙醇浓度 77.02%、料液比 1 ∶23.82（g/mL）。考虑工艺的可操作性，将参数调整为：温度40 ℃、时间40 min、乙醇浓度 75%、料液比 1 ∶25（g/mL）。在此条件下，黄酮理论提取率为2.05%。

2.2.3 响应面交互作用分析

为了更直观地表现各因素交互作用对黄酮提取率的影响，采用 Design Expert8．0．6 软件处理数据，所得等高线与三维响应曲面见图6～图11。响应面开口均向下，响应面值均随每个因素增大而增大，当达到极值后，响应面值逐渐减小。

图6 乙醇浓度和提取时间对黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面Fig.6 The effect of alcohol concentration and extraction time on contour map and the response surface

图7 乙醇浓度和料液比对黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面Fig.7 The effect of alcohol concentration and solid liquid ratio on contour map and the response surface

图8 乙醇浓度和温度对黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面Fig.8 The effect of alcohol concentration and extraction temperature on contour map and the response surface

图9 提取时间和料液比对黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面Fig.9 The effect of alcohol concentration and solid liquid ratio on contour map and the response surface

图10 提取时间和温度对黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面Fig.10 The effect of extraction time and temperature on contour map and the response surface

图11 料液比和温度对黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面Fig.11 The effect of solid liquid ratio and extraction temperature on contour map and the response surface

2.3 最佳工艺条件下的验证试验

为了验证模型的有效性，进行重复验证试验，所得金线草黄酮平均提取率为2.34%，高于理论预测值（2.05%），表明预测值与实际值之间具有较好的拟合性。同时，采用超声波辅助提取工艺与之相比较，在料液比为 1 ∶23（g/mL），乙醇浓度为 75%，超声波提取时间为11 min 条件下，所得提取率为2.576%，而本试验所选用的回流提取法可以通过延长提取时间，来获得与超声波提取法相近的提取效果，从而表明该回归数学模型可以很好地预测不同条件下的提取率，具有一定的实用价值。

3 结论

本试验采用乙醇回流法提取金线草中的黄酮类化合物，逐一研究影响提取结果的4 个因素：乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比，并采用响应面优化试验设计，建立了金线草黄酮提取工艺的数学模型。该回归模型显示了金线草黄酮提取率与4 个因素之间的关系，能很好地预测试验结果。

对该数学模型进行分析，得出金线草黄酮提取的最佳工艺条件：乙醇浓度75%、提取时间40 min、提取温度 40 ℃、料液比 1 ∶25（g/mL）。在此条件下，金线草黄酮提取率为2.34%，高于理论预测值（2.05%），表明该数学模型对黄酮类化合物的提取工艺具有一定的理论价值，对金线草资源的综合利用和黄酮产品的工业化生产具有较强的实践指导意义。