微囊藻毒素的液-质谱联用和直接进样检测方法比较

李诗言 崔益玮 王 扬 戴志远 沈 清 *

（1浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310012

2浙江省水产质量检测中心 杭州 310023

3浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310012）

微囊藻毒素（Microcystins）为蓝藻水华释放的一类具有强烈致癌作用的肝毒素，其毒性较大，分布广泛，目前已发现异构体约80余种，其结构由7个氨基酸组成，主要产自微囊藻（Microcystis aeruginosa）、鱼腥藻（Anabaena）、念珠藻（Notoc）等浮游性蓝藻，化学结构如图1所示，其中MC-LR最为常见[1]。调查表明，我国60%的水体由于过多接纳了氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生了重大变化，导致藻类的异常繁殖生长，从而出现蓝藻水华现象[2]。水面湖靛堆积，大量消耗水中溶解氧致鱼类窒息死亡，藻体死亡分解过程中释放生物毒素类次级代谢产物，导致水体污染，水生动植物死亡[3]。MC进入人体肝细胞后，能强烈地抑制蛋白磷酸酶（PP1、PP2A）的活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，导致肝细胞微丝分解、破裂和出血[4]。

食品中的微囊藻毒素的分析监测对于维护食品安全和人类健康具有重要意义。微囊藻毒素被列为有机污染毒素的监测项目，并有国家标准推荐的水体中微囊藻毒素的安全质量浓度为1 μg/L。目前主要化学分析法包括薄层色谱（TLC）[5]、气相色谱（GC）[6]、液相色谱（LC）[7]、毛细管电泳（CE）[8]等。其中高效液相色谱法（HPLC）是目前应用最多的方法，利用液相色谱的特点，与质谱或核磁共振联用确定其分子式和结构[9]。该方法分析速度快，灵敏度高，结构准确稳定。该方法只针对目标化合物，对于潜在的异构体无法检测。

本试验针对微囊藻毒素化学结构中具有共同母核的结构特征，创新性地采用PreIS的扫描方式，建立DIA检测法，经质谱分析并优化相关参数，以提高离子化效率，降低杂质干扰。通过比较LC-MS/MS和DIA两种方法的线性、精密度、灵敏度、回收率、经济性等参数，建立稳定、高效的微囊藻毒素分析方法，用于快速分析水体及动植物中的残留，确定监测物种、采样站位和频率、警戒值和防控反应机制等，为相关部门完善和强化水产品监测和管理工作提供科学依据，从而保障食用安全和近岸养殖业的健康发展。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

1200高效液相色谱系统，美国Agilent公司；4000QTrap串联飞行时间质谱仪，美国Ab Sciex公司，配有Harvard Pump11恒流注射泵、电喷雾离子源（ESI）及Analyst1.5数据处理系统；Sanorius BS110S分析天平，北京赛多利斯公司；MDF-382E超低温冰箱，日本Sanyo公司；Milliplus 2150超纯水处理系统，美国Millipore公司。

1.2 主要材料与试剂

微囊藻毒素 MC-RR，YR，LR，LA，LF，LY 及LW标准品（纯度＞95.0%）：台湾 Algal Science公司，化学结构见图1；Oasis HLB固相萃取柱，美国Waters公司；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和甲酸（FA），德国Merck公司，色谱纯；纯净水，由Milli-Q超纯水处理系统制得；其他试剂均为分析纯；螺蛳购买自杭州物美超市，新鲜度佳。

准确称取微囊藻毒素标准品各0.01 g，用甲醇溶解于10 mL棕色容量瓶并定容，分别配置成1.0 mg/mL的储备液至于4～6℃冷藏备用。

1.3 样品处理

将10 g螺蛳肌肉组织研磨均质，取1 g置于5 mL离心管，加入5 mL萃取液（MeOH/water/FA，90/9.9/0.1，V/V）后振荡混匀20 min，并用探头式超声（25 kHz，60%变幅）提取 10 min。完毕后混合物用冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）以8 000 r/min离心15 min。用移液枪转移离心管中上清液到另一个新的移液管，并继续向沉淀中加入5 mL萃取液并重复上述操作提取两次。将3次提取的上清液合并，用氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶至约1 mL。

Oasis HLB固相萃取柱分别用6 mL甲醇和水活化。萃取液均匀上柱，并依次用6 mL纯水和淋洗液（MeOH/water，5/95，V/V）淋洗，弃去淋洗液，以5 mL纯甲醇洗脱吸附在HLB柱上的微囊藻毒素，流速控制在1滴/s左右，收集洗脱液。将洗脱液用氮气流吹干，使用初始流动相复溶至1 mL后过0.22 μm有机滤膜，滤液待仪器分析。

1.4 试验条件

1.4.1 LC-MS/MS条件 色谱柱：Waters XSelect HSS T3（2.1 mm × 150 mm，3.5 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱：ini，25%B；0～1 min，25%B；1～5 min，25%～95%B；5～9 min，95%B；9～10，95%～25%B；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应离子检测模式（MRM），喷雾电压5.5 kV，干燥温度450℃，源内碰撞诱导解离气为氮气，气帘气30 psi，GS1 为 35 psi，GS2 为 55 psi。

1.4.2 直接进样条件 注射泵进样流速20 μL/min；质量扫描范围m/z 400～600。电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，PreIS 离子检测模式，特征碎片离子为m/z 135.2，喷雾电压5.5 kV，干燥温度550℃，源内碰撞诱导解离气为氮气。

2 结果与讨论

2.1 微囊藻毒素离子化特征分析

微囊藻毒素的离子化特征是影响分析结果的重要因素之一。试验首先通过注射进样1 ng/mL的各微囊藻毒素标准品进行Q1全扫描。微囊藻毒素在正离子模式的离子化效率显著优于负离子模式，各个标准品的双电荷和单电荷离子峰均有检出，如质子化、钠离子化、钾离子化及组合离子化（[M+H+Na]2+）等。鉴于实际样品检测过程中复杂基质干扰易造成双电荷和单电荷离子峰强度比例波动，进而影响定量结果，需优化检测条件，尽可能使微囊藻毒素离子结构单一化。结果发现向溶剂中添加0.1%的甲酸可显著提高微囊藻毒素双电荷离子强度，抑制单电荷离子强度（图2）。因此，本试验7种微囊藻毒素均采用[M+2H]2+为MRM模式的母离子。该试验结果与部分报道有所不同，Beltrán检测了6种微囊藻毒素发现除了MC-RR易形成双电荷[M+2H]2+外，其余均检测为[M+H]+[10]；王超等[11]建立了反复冻融-固相萃取-液相色谱串联质谱法测定蓝藻中5种微囊藻毒素的方法，选用MC-RR、MC-YR和MC-LR的[M+2H]2+为母离子，其余为[M+H]+。本试验进一步通过安捷伦6540 QToF离子化验证，初步认定不同厂家的质谱仪均会对微囊藻毒素离子化行为造成显著影响。由于微囊藻毒素离子化行为的特殊性，建议针对不同质谱仪建立相应标准化检测方法。

图1 微囊藻毒素骨架结构图与微囊藻毒素R1和R2位置官能团结构图Fig.1 The chemical structures of microcystin backbone and the groups of R1and R2

2.2 直接进样条件优化

直接进样法是一种基于三重四极杆质谱仪，利用特征官能团，通过离子源内分离实现对不同样品中目标化合物快速扫描的方法。该方法主要利用母离子扫描模式，选定目标化合物经碰撞诱导解离产生的共有母核，同步检测对应母离子及含相同母核的同系物。目前直接进样法应用于磷酸化多肽[12]、天然产物[13]、脂质组学[14-15]等研究。本试验通过注射进样1 ng/mL的各微囊藻毒素标准品进行子离子扫描检测，微囊藻毒素裂解产生的碎片较多，典型碎片包括m/z 213.2、m/z 163.0、m/z135.2、m/z 105.2、m/z 103.1 等（表1），其中 m/z 135.2为微囊藻毒素的共有基团Adda的甲氧键断裂形成的特征碎片峰，该峰丰度最强，故设定m/z135.2为特征子离子扫描含有该母核的目标化合物。由于母离子扫描模式下无法针对各个微囊藻毒素单独设置DP和CE，通过折衷优化选定DP 60 eV和CE 55 eV。直接进样法母离子扫描模式下7种微囊藻毒素质谱图见图3，各微囊藻毒素的离子峰较为纯净，均主要以[M+2H]2+为主，钠离子化和钾离子化峰不明显。

2.3 LC-MS/MS条件优化

向流动相A、B中分别加入0.1%的甲酸，使微囊藻毒素的液相环境与针泵优化时条件一致，最大化双电荷离子化微囊藻毒素质谱峰丰度。采用流动注射的方式优化得到最佳质谱参数喷雾电压5.5 kV，干燥温度 450℃，源内气帘气 30 psi，GS1为35 psi，GS2为55 psi，并对不同微囊藻毒素优化去簇电压（DP）和碰撞电压（CE）结果见表1。

图2 甲酸酸化微囊藻毒素全扫描模式下质谱图Fig.2 The mass spectrogram of microcystins under Q1 full scan with formic acid

图3 直接进样法母离子扫描模式下检测7种微囊藻毒素Fig.3 PreIS of seven microcystins by direct injection method

表1 微囊藻毒素质谱参数Table 1 The parameters of mass spectrometry for microcystins

使用梯度洗脱7种微囊藻毒素并在10 min内实现基线分离，峰型尖锐、对称（图4），出峰顺序为 MC-RR、YR、LR、LA、LY、LW 及 LF，对应的保留时间分别 为 6.52，6.93，7.01，8.20，8.25，8.74及9.01 min。含精氨酸（R）片段的微囊藻毒素（MC-RR、YR和LR）极性较强，尤其MC-RR含有两个精氨酸片段，故首先出峰，MC-LW和LF的保留时间较长，主要由于其侧链苯环增加了与C18固定相之间的疏水作用，进而提高了其在色谱柱上的保留能力。

2.4 方法比较

逐级稀释标准混合工作液分别进行LC-MS/MS和DIA检测，测定结果经统计软件分析计算标准曲线线性，以S/N=3所对应的被测化合物的含量作方法的检出限（LOD），以S/N=10所对应的被测化合物的含量作方法的定量下限（LOQ）；于空白螺蛳样品中分别加入10 μg/L含量的微囊藻毒素标样，每组做6个平行样品，分析并测定精密度及回收率，试验结果见表2。使用LC-MS/MS建立的微囊藻毒素标准曲线线性（0.9965～0.9993）优于DIA标准曲线（0.9907～0.9968）。由于微囊藻毒素在针泵进样时样品未经预分离直接源内离子化，离子化竞争较为激烈，导致单个微囊藻毒素离子化效率降低，而LC-MS/MS中混合样品经色谱预分离，源内单个微囊藻毒素较为纯净，因此DIA的LOD和LOQ均高于LC-MS/MS。LC-MS/MS微囊藻毒素回收率范围在73.9%～83.4%（RSD 3.6%～6.1%），而DIA的回收率在69.3%～84.2%（7.6%～9.8%）。相比之下，DIA分析时间较短，同时检测7种微囊藻毒素仅需1 min即可完成，而LC-MS/MS需要10 min才能检测完成。除此之外，DIA无需液相色谱柱和流动相溶剂，可大大缩减耗材成本、减轻环境负担。

图4 多反应监测模式下7种微囊藻毒素的提取离子流图Fig.4 The extracted ion chromatography of seven microcystins under MRM mode

2.5 实际样品分析

螺蛳样品采自本地农贸市场，两种检测方法均从60个随机样品中检出阳性样品38个。结果显示主要微囊藻毒素污染种类为MC-RR和LR，MC-YR、LA、LF、LY 及 LW 均未检出；以螺蛳为代表的淡水生物微囊藻毒素污染较为严重，阳性率达到了63.3%，间接反映河道水体富营养化污染，藻类大量繁殖，释放毒素并通过食物链生物富集对人类健康造成威胁。

3 结论

本试验分别采用了LC-MS/MS和DIA对7种微囊藻毒素进行了分析检测。LC-MS/MS是目前最为广泛使用的化合物定量方法，通过甲酸酸化溶剂抑制单电荷离子强度，选用双电荷离子为MRM定量定性母离子大大提高了方法稳定性。DIA为新型快速检测技术，选定碎片m/z 135.2可快速筛查所有含有该母核的微囊藻毒素，该方法目前尚未见国内外文献报道。通过比较发现两种方法在精确度、灵敏度、回收率、耗时等方面各有优缺点。根据研究结果建议当待测样品数量较多时，首先采用DIA进行初次筛选，对于阳性样品利用LC-MS/MS进行二次检测。该分析测试策略可有效减少检测时间、色谱柱损耗及溶剂消耗，提高效率、降低成本；同时阳性样品先后经DIA和LC-MS/MS检测相当于对结果进行了二次验证，提高了结果的可靠性。

表2 微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱法和直接进样法效率比较Table 2 The performance comparison of LC-MS/MS and direct injection methods for the analysis of microcystins