加味黄芪建中汤对脾虚Lewis肺癌小鼠QKI7、Wnt1及MMP2表达的影响

朱伟 包素珍 姜涛 钱钧 魏自太* 王彩云

肺癌作为全球常见的恶性肿瘤之一，已成为较多国家病死率最高的恶性肿瘤［1］。由于大部分肺癌患者在确诊时已是晚期，或已经出现转移，错过最佳的治疗机会，故5年生存率＜15%［2］。因此如何阻止肺癌的侵袭和转移是研究者关注的重点。现代研究表明，肺癌的发生多与免疫力下降有密切关系。中药复方针对气虚证的治疗不仅能在一定程度上改善患者的免疫功能，同时还可明显抑制肺癌细胞增殖、侵袭及迁移等生物学行为能力的改变，从而有效改善肿瘤血管的生长状态，抑制肺癌的进展［3］。本文通过观察加味黄芪建中汤对脾虚Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Wnt1、QKI7及MMP2表达的影响，探讨其治疗脾气虚证肺癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级C57BL/6小鼠50只，6～8周龄，体重（20±2）g，均为雌性，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证：SCXK（沪）2013-0016。实验时间2017年8月至2018年3月。

1.2 药物制备 加味黄芪建中汤组成：黄芪9g、白芍18g、桂枝9g、甘草6g、生姜10g、大枣10g、饴糖30g、浙贝母10g、白花蛇舌草30g、仙鹤草12g（由浙江中医药大学滨江门诊部提供）。上述药物经水煎、过滤、浓缩、灭菌后制成汤剂（含生药浓度为1mg/ml）。生大黄浸出液：生大黄300g，加入1800ml蒸馏水后搅拌混均，放入50℃的水浴箱中，搅拌1次/30min，6h后绞液去渣，再倒入负压旋转蒸发仪，用50℃水浴浓缩制成生大黄浸出液（含生药浓度为1mg/ml）。上述制剂放置4℃冰箱保存备用。

1.3 试剂及仪器 D-木糖标准品储备液2ml×1支（批号：20161115，南京建成生物工程研究所）；标准品稀释液10ml×1支（批号：20161002，南京建成生物工程研究所）；胃泌素放射免疫分析药盒（批号：20161123，南京建成生物工程研究所）；兔抗小鼠 QKI7（一抗）（Merck-Millipore，批号：2900158）；兔抗小鼠Wnt1抗体（一抗）（CST，批号：324114-1）；兔抗小鼠MMP2抗体（一抗）（R&D，批号：0417041）；免疫组化Power Vision二步法试剂盒及DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公 司 ）；PBS 液：NaCl 185g、Na2HPO4.12H2O 58g、NaH2PO4.12H2O 3g、蒸馈水1L混匀。rTdT 缓冲液：Buffer 45μl、MIX 5μl、rTdT 1μl配 制 成 50μl rTdT缓冲液，避光。甲醇、苏木精染液、伊红染液（南昌雨露实验器材有限公司）；液氮（杭州悦通气体技术开发有限公司）；无水乙醇（上海生工生物工程有限公司）；R-501旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）；W-O恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）；P-250A-B型高速多功能粉碎机（浙江永康久品工贸有限公司）；DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；HYC-118海尔医用冷藏箱（山东青岛海尔股份有限公司）；切片机（德国徕卡仪器有限公司）；自动组织包埋机（德国Microm International GmbH）；倒置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；5417R型离心机（德国艾本德股份公司）；NanoDrop 2000微量核酸蛋白检测仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Bio-RADIQ5 Multicolor-Real-Time荧光定量PCR仪（Bio-RAD）。

1.4 模型建立及给药 脾虚小鼠模型建立：将50只C57BL/6小鼠在动物实验中心常规适应饲养1周，随机取30只，采用苦寒泻下法+饥饿法+疲劳法建立脾气虚模型。具体步骤：给予大黄浓缩液灌胃，1ml/（20g·d），分2次，同时每日游泳至力竭，并间隔1日节食，连续14d。从第3、4天起小鼠开始出现大便溏泻；5d后出现不同程度的嗜卧、倦怠等症状。期间由于灌胃不当及游泳溺水死亡3只。造模第15天，分别从正常和模型小鼠中随机各取10只小鼠，称重并眼球取血后，测血清D-木糖和胃泌素水平，以验证脾虚模型成功。脾虚模型成功后，停止大黄灌胃。荷瘤小鼠模型建立：取传代后第13天C57BL/6荷瘤小鼠（由浙江中医药大学动物研究中心提供），脱颈椎处死，在无菌条件下，对操作部位皮肤以酒精消毒，小鼠皮肤下剥取新鲜无坏死Lewis肿瘤组织，置于无菌平皿中；用消毒剪刀将肿瘤块剪碎，加生理盐水于研磨器中反复研磨，于200目筛网过滤，制成肿瘤细胞悬液；于显微镜下计算癌细胞数目，用生理盐水将肿瘤细胞浓度调整为1×107个/ml；将正常组10只和脾虚组17只小鼠接种肿瘤，取上述肿瘤细胞悬液0.2ml，接种于小鼠右腋部皮下，采集肿瘤组织到最后一只小鼠接种完成控制在＜2h。在接种Lewis肿瘤组织后，随机将实验小鼠分为3组：①单纯肺癌组（10只）：生理盐水灌胃，1次/d，0.4ml/次；②脾虚肺癌组（8只）：生理盐水灌胃，1次/d，0.4ml/次；③脾虚肺癌用药组（9只）：中药加味黄芪建中汤灌胃，1次/d，0.4ml/次；各组按以上方法给药，连续15d后，进食不禁水12h，第16天脱颈椎处死小鼠。

1.5 观察指标 小鼠眼眶取血0.4ml，分离血清后置于-80℃冰箱。比色法测定血清D-木糖含量，用Elisa法测定血清胃泌素水平，具体操作严格按试剂盒说明书进行。检测肿瘤重量、肺转移结节数：在处死小鼠后，无菌剥取皮下瘤块称重；分离气管，取出肺脏，浸入Bouin液固定后对肺表面转移结节数观察计数。

1.6 RT-PCR检测肿瘤组织Wnt1、QKI7含量 采用Trizol提取总RNA，微量核酸蛋白检测仪测定浓度，取5μg总RNA，利用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工生物工程有限公司）逆转录为c-DNA，逆转录条件42℃，45min；70℃，10min后迅速置于冰上备用。引物由上海生工生物工程有限公司负责合成，以Wnt1为内参，小鼠Wnt1上游引物：5'-CTACTGGCACTGACCGCTCT-3’，下游引物：5'-CTTGGAATCCGTCAACAGGT’，小鼠QKI7上游引物：5'-GCTGAAGAGAGCGGTTGAAG-3’，下游引物：5'-GCGTCTCTGTAGGTGCCATT-3’，反应条件：95℃，3min；95℃，15s；56℃，20s，共40个循环，检测荧光信号。每个样品做3个平行管，各个基因的相对表达水平以2-△△Ct进行统计分析。

1.7 免疫组织化学法检测肿瘤组织中MMP2的表达 石蜡切片常规脱蜡至水化，切片入微波处理液，微波加温90～98℃10min，冷却后蒸馏水稍洗，3%双氧水消除内源性过氧化物酶5min，PBS洗3次3min，滴加第一抗体置37℃孵育30min，PBS洗3次3min，滴加第二抗体置37℃孵育30min，PBS洗3次3min，DAB-H2O2显色，流水冲洗，Mayers苏木素复染细胞核1～2min；流水冲洗数分钟，常规脱水封片。MMP2阳性表达均在胞核，呈现棕黄色颗粒，每张片在400倍视野下任意选取10个视野，每张片最少计数500个细胞，计算每一百个细胞中的阳性细胞数采用百分数计数法。MMP2阳性表达率=阳性表达数/总细胞数×100%。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料数以（s）表示，两组间用t检验，多组间用单因素方差分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组与脾气虚证模型组小鼠血清D-木糖和胃泌素水平比较 见表1。

表1 正常组和脾气虚组小鼠D-木糖和胃泌素变化（s）

表1 正常组和脾气虚组小鼠D-木糖和胃泌素变化（s）

注：与正常组比较，*P＜0.05

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2.2 肺癌组、脾虚肺癌组和脾虚肺癌用药组小鼠皮下肿瘤重量及肺转移结节数比较 见表2。

表2 各组肿瘤组织中瘤重及肺转移结节情况比较（s）

表2 各组肿瘤组织中瘤重及肺转移结节情况比较（s）

注：与单纯肺癌组比较，*P＜0.05；与脾虚肺癌组比较，#P＜0.05

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2.3 各组肿瘤组织中Wnt1表达情况比较 见表3。

表3 各组肿瘤组织中Wnt1表达情况比较（s）

表3 各组肿瘤组织中Wnt1表达情况比较（s）

注：与肺癌对照组比较，*P＜0.05；与脾虚证肺癌组比较，#P＜0.01

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2.4 各组肿瘤组织中QKI7表达情况比较 见表4。

表4 各组肿瘤组织中QKI7表达情况比较（s）

表4 各组肿瘤组织中QKI7表达情况比较（s）

注：与肺癌对照组比较，*P＜0.05；与脾虚证肺癌组比较，#P＜0.01

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2.5 各组肿瘤组织中MMP2阳性表达率比较 见表5、图 1～3。

表5 各组肿瘤组织中MMP2阳性表达率比较（s）

表5 各组肿瘤组织中MMP2阳性表达率比较（s）

注：与肺癌对照组比较，*P＜0.05；与脾虚证肺癌组比较，#P＜0.01

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图1 单纯肺癌组MMP2的阳性表达

图2 脾虚肺癌组MMP2的阳性表达

图3 脾虚肺癌用药组MMP2的阳性表达

3 讨论

肿瘤微环境（TME）主要是由基质细胞和肿瘤细胞组成，TME包含巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞、构成血管的细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和细胞外基质（ECM）等。而在这些细胞中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境（TME）中最重要的组成部分，其能够促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移。Wnt1作为Wnt家族中的一员，在多种肿瘤的发生发展中具有重要意义［4］。Wnt1可通过合成特殊的RNA和蛋白质，进入细胞核促进细胞DNA复制，促进细胞分裂增殖。Wnt1可作为评价肺癌患者预后的一个重要指标。研究发现，RNA结合蛋白QKI与低氧诱导因子（HIF-1）对肿瘤细胞的细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管新生以及细胞周期均有重要的调控作用，且与预后相关［5］。基质金属蛋白酶（MMPS）是一组由结缔组织细胞分泌的、参与细胞外基质构成的蛋白酶家族，MMP2是MMPS家族的一员，大量研究表明，MMP2在多种肿瘤组织中呈过度表达，与肿瘤的侵袭与转移密切相关［6］。

本实验加味黄芪建中汤为黄芪建中汤加白花蛇舌草、仙鹤草、浙贝三味中药，白花蛇舌草主要功效是清热解毒、消痈散结、利尿除湿。临床常应用白花蛇舌草配方治疗各种癌症。仙鹤草具有收敛止血、截疟、止痢、解毒等功效，研究发现，仙鹤草还具有较强的抗癌功效。浙贝归肺、心经，主要功效为清热化痰、降气止咳、散结消肿。浙贝母碱是中药浙贝母的主要成分，近年来其抗肿瘤、逆转耐药的作用逐渐得到认同。在补脾基础上，加强抗肿瘤功效。

本资料中，造模后脾虚小鼠血清D-木糖和胃泌素水平较正常组明显下降，并且小鼠出现纳少、便溏、成群蜷缩、四肢乏力、体重下降等脾虚典型症状。对模型组小鼠接种Lewis肿瘤后，瘤体较单纯肺癌组明显增大，RT-PCR结果显示在脾虚肺癌小鼠中Wnt1、MMP2的表达较单纯肺癌组明显升高，QKI7的表达明显降低。而经过加味黄芪建中汤治疗后，小鼠瘤体较脾虚肺癌组明显减小，相对单纯肺癌组也有缩小的趋势，提示加味黄芪建中汤对脾虚证肺癌有较好的疗效，同时Wnt1、MMP2的表达有明显下降，而QKI7的表达明显升高。表明加味黄芪建中汤可通过调节QKI7、Wnt1及MMP2的表达，抑制脾虚证Lewis肺癌肿瘤细胞增殖的作用。