高效液相色谱法检测不同施肥栽培黄芪的毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪甲苷含量

王亚丽，田曼，王昌利，颜永刚，张岗

黄芪为豆科植物蒙古黄芪［Astrɑgɑlus membrɑnɑceus（Fisch.）Bge.vɑr.mongholicus（Bge.）Hsiɑo］或膜荚黄芪［Astrɑgɑlus membrɑnɑceus（Fisch.）Bge.］的干燥根。黄芪含多种化学成分，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷是其主要活性成分，具有抗炎、降血糖、调节免疫、强心和保护肝脏等作用，对心脑血管疾病，糖尿病及肝损伤等疾病有良好的疗效［1-6］。据文献报道，高星等［7］研究了氮、磷、钾三种肥料元素的不同配比对黄芪中黄酮类及皂苷类成分的影响，张金文［8］研究了有机与无机复混配方肥不同施用量对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪甲苷含量的影响，而单施有机肥、化学肥及其施肥量对黄芪中主要有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量影响却少见报道。《中药材生产质量管理规范》（国家药品监督管理局令第32号）要求施肥种类以有机肥为主，根据不同药用植物生长发育的需求有限度地使用化学肥料。本实验于2016年3—11月设计了有机肥和化学肥2种肥料种类的12种不同施肥处理，采用高效液相色谱法（HPLC）比较分析了黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪甲苷含量的差异，为进一步研究黄芪栽培中合理施肥提供实验依据。

1 材料与方法

1.1仪器Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器（DAD），Waters 2420蒸发光散射检测器（ELSD）。

1.2试药黄芪药材样品采自甘肃省宕昌县步长集团黄芪种植基地，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为豆科植物蒙古黄芪的干燥根。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号10305-201702）、黄芪甲苷（批号10212-201603）对照品均购于南昌贝塔生物科技有限公司，质量分数均≥98%，实验用水为杭州娃哈哈集团有限公司的娃哈哈纯净水，乙腈和甲醇为美国赛默飞世尔科技有限公司的色谱纯，甲酸为天津市科密欧化学试剂有限公司的色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3研究方法施肥实验共设12个处理，肥料种类及施肥量的实验设计见表1。2016年2月27日施肥，肥料作基肥，黄芪种苗于2016年3月4日移栽，栽培方式为不覆膜平地开沟栽植，小区之间开30 cm×50 cm沟，每小区面积为24 m2，采用南北行向，长×宽=6 m×4 m，实验采用随机区组设计，各处理重复3次，各处理田间管理水平相同。于2016年11月5日收获，干燥后采用HPLC-DAD测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，HPLC-ELSD测定黄芪甲苷含量。

表1 黄芪栽培采用施肥肥料的种类及施肥量

1.4色谱条件

1.4.1毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30℃；流动相为0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱0～30 min，15%B→30%B；30～40 min，30%B→15%B；系统平衡时间10 min；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长260 nm。

1.4.2黄芪甲苷色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相为乙腈-水（32：68）；流速 1.0 mL/min；进样量10 μL；ELSD漂移管温度60℃，喷雾器温度36℃，增益值130，供气压力172.38 kPa。

1.5对照品溶液的制备精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.65 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声溶解作为对照品溶液C。精密称定黄芪甲苷0.74 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声溶解作为对照品溶液D。

1.6供试品溶液的制备将甘肃省宕昌县黄芪药材在50℃烘箱中干燥24 h，打粉，过45目筛，精密称量粉末5.0 g，置500 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇200 mL，浸12 h后，加热回流提取3次，每次1 h，过滤，滤液蒸干，加100 mL水溶解残渣，将溶液转移到分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次200 mL，弃去石油醚层，将非石油醚层转移到蒸发皿中，浓缩干燥，加甲醇定容到10 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.7统计学方法采用Excel 2013、SPSS 19.0对数据进行处理分析，多组计量资料比较采用方差分析，组间多重比较使用最小显著性差异法（LSD），两计量资料关系采用线性回归及相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1线性关系考察

2.1.1毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系考察 将“1.5”项下对照品溶液C按“1.4.1”色谱条件依次进样1、5、10、15、20、25 μL，重复测定3次，以进样量为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），线性回归方程为：Y̑1=3 022 248.15x+121 954.72，r1=0.999 9，P1＜0.001，相关性差异有统计学意义，表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.33～8.25 μg范围内与峰面积线性关系良好。色谱图见图1。

2.1.2黄芪甲苷线性关系考察 将“1.5”项下对照品溶液D按“1.4.1”色谱条件依次进样1、5、10、15、20、25 μL，重复测定3次，以进样量的对数为横坐标（X），峰面积的对数（Y）为纵坐标，线性回归方程为：Y̑2=0.981 1x+5.606 7，r2=0.999 0，P2＜0.001，相关性差异有统计学意义，表明黄芪甲苷在0.146～3.65 μg范围内与峰面积线性关系良好。色谱图见图2。

2.2测定结果精密称取不同施肥处理的黄芪粉末，按“1.6”项下方法制备供试品溶液，按“1.4”项下色谱条件进行测定，分别计算毛蕊异黄酮萄糖苷及黄芪甲苷含量。对不同施肥处理的各实验小区单根重、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累量、黄芪甲苷含量和黄芪甲苷积累量进行方差分析。方差分析的结果表明，不同施肥各处理间差异有统计学意义（P＜0.01），说明不同施肥处理对黄芪单根重、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量有影响，结果见表2。

图1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（A）及黄芪样品（B）色谱图

图2 黄芪甲苷对照品（A）及黄芪样品（B）色谱图

表2 不同施肥处理黄芪单根重、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量及积累量方差分析

进一步对各处理采用LSD法进行多重比较，结果见表3。处理B单根重最重，为（56.88±2.46）g，约为处理A的1.4倍，除了与处理F之间差异无统计学意义外，与其他处理均差异有统计学意义；毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量及其积累量均以处理B最高，分别约为处理A的4.6倍和6.3倍，处理F次之，分别约为处理A的4.4倍和5.6倍，处理B、F均与处理A差异有统计学意义；黄芪甲苷含量及其积累量均以处理F最高，分别约为处理A的2.6倍和3.4倍，其次为处理B，分别约为处理A的2.4倍和3.3倍，处理B、F之间差异无统计学意义，与处理A差异有统计学意义。施肥栽培的11种处理方式，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的含量及积累量均显著高于不施肥栽培（处理A），整体而言，处理B下的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的含量及积累量最高。

3 讨论

3.1提取方法的考察通过查阅文献发现，同时提取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷成分主要是超声提取和加热回流提取［9-12］，提取溶剂多为甲醇和95%乙醇，本实验为提高毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷提取率，在现有文献的基础上分别考察了超声提取和加热回流提取方法，同时还考察了不同提取溶剂、提取时间和提取次数对提取率的影响，最终结果表明，80%甲醇加热回流提取3次，每次提取1 h效率最高。参照2015年版中国药典中黄芪项下黄芪甲苷的含量测定方法，本实验方法与药典中的方法相比，省去了水饱和正丁醇萃取、氨试液及D101型大孔吸附树脂柱洗脱步骤，简化了样品处理方法。

3.2含量测定结果分析实验结果表明，相比不施肥处理，有机肥处理和化学肥处理对黄芪单株根重和黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的含量均有所增加，且各施肥处理下黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均达到《中国药典》2015年版一部的标准，黄芪甲苷含量在施尿素量为20 kg/667 m2和过磷酸钙15 kg/667 m2处理下低于药典标准，其余各施肥处理下的黄芪甲苷含量均达到《中国药典》2015年版一部的标准，分析其原因可能是因为本实验提取方法与药典相比省去了氨试液洗脱，据文献报道，氨试液可以将样品中其他皂苷类成分在碱的作用下水解掉乙酰基而提高黄芪甲苷的含量［13］。由于本实验未经过氨试液处理，从而降低了黄芪中其他皂苷类成分向黄芪甲苷的转化，这更加准确地检测出黄芪药材中以原型存在的黄芪甲苷的含量。毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量及积累量在施尿素量为10 kg/667 m2处理下最高，黄芪甲苷含量及积累量在施尿素量为10 kg/667 m2处理下居第2，两种有效成分的含量及积累量均高于施尿素量为15 kg/667 m2和20 kg/667 m2，说明施尿素肥在一定范围内有助于提高黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量，但尿素施肥量过高反而不利于这两种有效成分的积累。在单施有机肥和磷酸二铵中，整体而言，以施有机肥量为3 600 kg/667 m2处理下毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量相对较高，但对提高黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量的效果却不及过磷酸钙和尿素。

表3 不同施肥处理黄芪单根重、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量及积累量（n=3）

总之，合理施肥对于改善药材品质具有重要意义，本研究在不同施肥种类的基础上，初步研究了不同施肥量对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪甲苷含量的影响，为进一步研究黄芪栽培的合理施肥提供实验依据。