精氨酸加压素联合丹参素对骨质疏松患者成骨细胞凋亡及增殖的影响

曹子君，王亚兰，陈妮妮，郝定均，李青梅，胡靖，张正平，董亮

(1.西北工业大学保健室，陕西 西安 710072；2.西安交通大学附属红会医院，陕西 西安 710054)

骨质疏松是一类以骨密度降低为典型症状的疾病，临床主要为腰背疼痛、椎体变形、骨骼疼痛等，发病的主要机理为骨质减少，使骨的微结构遭到破坏，进而引发骨质脆性增加、弹性下降。临床研究[1-3]认为，该病的发生与饮食结构、生活方式、激素水平等密切相关，且随着患者年龄的增长，发病率会大幅提升。骨质疏松不仅会引发患者疼痛、体型改变，还会大大增加骨折发生的几率，严重影响患者的日常生活。精氨酸加压素也称为血管加压素、抗利尿激素，是由下丘脑产生并储存于神经垂体的一类激素，在调节颅内压和脑组织代谢中发挥重要生理作用。丹参素是丹参水溶成分中的主要药效成分之一，具有抗氧化、提高机体免疫力等作用[4-5]。本研究拟通过精氨酸加压素联合丹参素对骨质疏松患者成骨细胞凋亡和增殖的影响观察，为临床干预治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选择1例来自西北工业大学保健室接受髋关节手术治疗的骨质疏松患者的骨组织为研究材料。患者为男性，59岁，因摔伤导致骨折，无其他合并症。患者签署知情同意书，并经医院伦理学会批准。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞培养 将取出的骨块使用生理盐水冲洗，而后转入无菌试管中置入细胞培养室中，使用骨块培养成骨细胞，具体步骤如下：(1)使用含有100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的平衡盐溶液冲洗骨组织；(2)将骨组织置入一无菌培养皿中，切骨小梁置入另一无菌培养皿；(3)加入D-hanks溶液浸泡骨小梁，去除骨组织上残留的脂肪及血液；(4)使用完全培养液调制细胞培养液；(5)将骨小梁切为碎块后置入细胞培养液中，使用骨组织接种环将骨小梁铺散于瓶底，37 ℃条件下培养，观察细胞生长满瓶底后，去除骨组织块，使用胰蛋白酶消化离心法提取成骨细胞。

1.2.2 分组干预 将成骨细胞使用胰蛋白酶适当消化后，将细胞吹打为单细胞悬液并计数，以1×104/L的浓度将细胞接种于培养板中，均分为A、B、C、D四组。A组细胞使用生理盐水实施干预，B组细胞加入100 nmol/L的精氨酸加压素实施干预，C组细胞加入20 μg/mL丹参素实施干预，D组细胞加入100 nmol/L的精氨酸加压素+20 μg/mL丹参素实施干预，4组细胞均干预3 d。

1.2.3 观察指标 (1)细胞凋亡的评估：在培养孔中加入20 μL质量浓度为5.0 g/L的MTT溶液，于37 ℃条件下继续培养4 h，而后吸去培养液中的上层清液，在培养孔中加入150 μL的DMSO，放置于水平振荡器上震荡10 min后使用甲臜充分溶解，而后于酶联免疫检测仪上设置490 nm波长条件下检测培养孔吸光度，进而推测细胞凋亡情况。(2)凋亡蛋白表达检测：检测4组细胞干预3 d后凋亡蛋白Bax、AIF、cyto-C蛋白的表达情况，并进行对比分析。(3)成骨细胞增殖计算：取生长良好的成骨细胞使用胰酶消化后，使用体积分数为1%双抗的α-MEM培养基和体积分数为12%的胎牛血清重悬细胞，并接种于6孔板中，24 h后，按分组条件实施干预，3 d后收集细胞，并取上层清液检测碱性磷酸酶，于450 nm波长处检测吸光度，计算细胞增殖情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞凋亡情况比较

干预3 d后，4组成骨细胞凋亡情况为D组最小，B和C组相近，A组最大。除B组和C组相比差异无统计学意义外(P>0.05)，其余各组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞凋亡情况比较

*P<0.05，与B组、C组、D组相比，#P<0.05，与D组相比。

2.2 各组凋亡蛋白表达情况比较

细胞凋亡相关蛋白Bax、AIF、cyto-C蛋白表达情况为D组最小，B和C组次之，A组最大。其中，D组明显低于B组和C组(P<0.05)，B组和C组明显低于A组(P<0.05)，B组和C组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组凋亡蛋白表达情况比较(x±s)

*P<0.05，与B组和C组相比；#P<0.05，与A组相比。

2.3 各组成骨细胞增殖及BMP-2增殖蛋白表达情况比较

4组细胞增殖情况及BMP-2增殖蛋白表达为D组最大，B和C组次之，A组最小。其中，D组高于B和C组(P<0.05)，B和C组高于A组(P<0.05)，B和C组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组成骨细胞增殖情况比较

*P<0.05，与B组和C组相比；#P<0.05，与A组相比。

3 讨论

骨质疏松是以骨骼重量减轻、骨骼微结构发生损坏致骨弹性降低的一类骨骼疾病，容易发生疼痛、骨折等临床现象。统计数据[6]显示，现阶段我国约有9千万骨质疏松患者，且该数字随着社会老龄化趋势的上升而逐年提升。骨质疏松不但会降低患者的骨密度，诱发疼痛、体态变化等现象，也会影响患者的生活质量，降低患者的自主生活能力。因此，如何通过治疗提高骨质疏松患者的骨密度是现阶段医务工作者研究的重点。现有临床研究[7]显示，骨质疏松的发病机理主要与患者的激素水平、营养状况、遗传因素等有关。王亚春等[8]的研究指出，相比于绝经前健康妇女，绝经后的骨质疏松妇女其雌激素水平会出现显著下降，同时骨标志物β-胶原降解产物水平也会出现显著变化，提示激素在骨质疏松的发病中发挥了重要作用。华关民等[9]的研究也指出，不同性别不同年龄个体骨质疏松及血清骨标志物水平存在明显的差异。

成骨细胞是由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来的，能够分泌多种生物活性物质，对骨形成和重建过程产生较大影响的一类细胞，是骨形成的主要功能细胞，在骨基质的合成、分泌和矿化过程中可发挥较大作用，其与破骨细胞的平衡是维持机体正常骨量的关键，一旦平衡被打破，则易出现骨质疏松等病理性改变。杨越华[10]的研究指出，氧化应激反应与骨质疏松形成具有密切联系，成骨细胞在过氧化状态下凋亡会明显增加，破坏成骨细胞与破骨细胞之间的平衡状态，进而诱发骨质疏松出现。另有研究指出，通过对去势大鼠破骨细胞及成骨细胞平衡的调节，能够显著缓解大鼠骨质疏松症状，提高其骨密度。以上研究均提示，对成骨细胞凋亡及增殖的干预就治疗骨质疏松具有重要意义。

本研究通过体外培养骨质疏松患者成骨细胞并分组实施干预的方式，就精氨酸加压素联合丹参素对骨质疏松患者成骨细胞凋亡及增殖的影响进行了探究，结果显示，相比于使用生理盐水进行干预的A组细胞，使用精氨酸加压素干预的B组及使用丹参素进行干预的C组细胞治疗后其凋亡情况明显较小，同时B、C两组细胞凋亡相关蛋白Bax、AIF、cyto-C表达情况也较A组明显降低。结合相关文献分析，骨质疏松的出现与个体激素水平有紧密的联系，而合成精氨酸加压素的垂体在激素分泌、保存中具有重要作用，垂体功能减退会导致个体骨量丢失，进而诱发骨质疏松。吴庆田等[11]通过将小鼠成骨细胞进行分组干预发现，加用精氨酸加压素的小鼠成骨细胞其细胞内cAMP水平会明显上升，而cAMP能够通过活化蛋白激酶A进而引发一系列生物学反应，如细胞增殖分化等，对成骨细胞的凋亡及增殖产生影响。丹参素具有显著的抗氧化作用，临床应用证实在治疗骨质疏松中具有较好的效果。王秉义等[12]通过将60只大鼠进行分组干预的方式发现，丹参素具有拮抗醋酸泼尼松龙诱导氧化应激所致骨质疏松大鼠中成骨细胞凋亡的作用，其机理为通过活化PI3k/Akt通路从而减少成骨细胞的凋亡。此外，丹参素中含有多个酚经基，能够提供活性氧进而阻止脂质过氧化反应，降低过氧化对成骨细胞造成的损伤。本研究结果还显示，精氨酸加压素联合丹参素能够更有效的抑制骨质疏松患者成骨细胞的凋亡，加快成骨细胞的增殖，分析其原因可能为两种药物合用能够从不同方面对成骨细胞产生影响，进而加快了成骨细胞的增殖。

综上所述，精氨酸加压素联合丹参素能够有效抑制骨质疏松患者成骨细胞凋亡，同时还可促进成骨细胞增殖，且效果优于单独干预，是临床值得推广的一种干预治疗方案。