丙泊酚通过抑制lncRNA ANRIL抑制非小细胞肺癌细胞增殖与迁移

秦妮娜，陈锴，刘磊

(1.延安大学附属医院麻醉科；2.延安大学附属医院肿瘤科二病区，陕西 延安 716000)

肺癌在全球恶性肿瘤的发病率和死亡率均具第一位，包括小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，后者约占总数80%[1]，为主要类型。手术治疗是NSCLC的主要根治方法，但很多患者确诊时失去了手术治疗的时机和指征。有研究[2]显示，NSCLC患者五年的生存率仍仅为15%，这主要是因为大多数NSCLC患者在就诊时已是晚期，从而增加了NSCLC致死的可能。丙泊酚的正式名称为2，6-二异丙基苯酚，为临床上常见的静脉麻醉药物，具有起效迅速、作用时间短、可控性强、清醒快而完全、副作用少等特点[3]。李柏森等[4]研究发现，丙泊酚具有抑制肿瘤增殖的作用，可阻止MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖与迁移，但对NSCLC细胞的影响尚无相关报道。长链非编码RNA-RNALL(lncRNA ANRIL)是一种长度≥200 ntt的RNA，在多种恶性肿瘤中异常表达，并与肿瘤细胞增殖与迁移等生物学过程密切相关[5]，能在转录后调控、表观遗传学、转录调控等方面调控基因的表达水平，与NSCLC的增殖、浸润、转移关系密切，但是具体的作用机制尚不明确[6-7]。本研究旨在探讨了丙泊酚在通过抑制lncRNA ANRIL抑制非小细胞肺癌细胞增殖与迁移中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

人NSCLC A549细胞系购自中国科学院上海细胞库。丙泊酚注射液购自意大利AstraZeneca公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；Annexin V FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自上海生工公司；MTT检测试剂盒购自日本同仁公司；Matrigel基质胶和Transwell小室购自美国BD公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组与处理 A549细胞用含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基进行培养，培养条件：5% CO2、37 ℃，培养2～3 d进行传代，待细胞长至80%融合时进行后续实验。实验1组与实验2组加入100 μmol、1 000 μmol丙泊酚(溶剂DMSO浓度为5%)100 μL，对照组加入5%DMSO 100 μL继续进行培养，处理后8 h进行换液。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 处理后24 h、48 h，将细胞以5×103个细胞/孔种植于96孔板中，每孔加入20 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，继续培养6 h后终止培养，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，用酶标仪于540 nm波长处检测光密度值，计算增殖活性。

1.2.3 Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 处理后24 h、48 h，1×106细胞密度接种于6孔培养板中，调整细胞浓度为5×105/mL左右，取200 μL的细胞悬液加入10 μL 的Annexin-FITC，再加入10 μL浓度20 μg/mL的PI锭，室温避光孵育10 min，重悬细胞，采用流式细胞仪记录细胞凋亡率。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移 处理后48 h，将细胞以3.4×104接种于transewell小室的上室中，下层加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基600 μL，将Transwell小室放进24孔板里，培养24 h后取出Transwell小室，采用多聚甲醛固定并用苏木素染色，显微镜下计数迁移距离与过膜细胞数。

1.2.5 实时定量PCR检测lncRNA ANRIL表达 处理后24 h、48 h，收集细胞，细胞总RNA均采用TRIzol法提取。LncRNA-ANRIL上游引物为：5′-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3′；下游引物为：5′-CTCTTCCTGGCTTGCAGATTG-3′。以U2作为内标，检测lncRNA ANRIL相对表达水平。

上述实验都重复3次，取平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 lncRNA ANRIL表达对比

处理后24 h、48 h，实验2组与实验1组的lncRNA ANRIL表达水平显著低于对照组(P<0.05)，实验2组低于实验1组(P<0.05)。见表1。

组别24 h48 h对照组(n=3)3.22±0.454.32±0.51实验1组(n=3)1.23±0.33*1.11±0.32*实验2组(n=3)0.67±0.29*#0.57±0.21*#F值40.87190.967P值<0.001<0.001

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与实验1组相比。

2.2 细胞增殖指数对比

处理后24 h、48 h，实验2组与实验1组的细胞增殖指数显著低于对照组(P<0.05)，实验2组低于实验1组(P<0.05)。见表2。

组别24 h48 h对照组(n=3)76.49±6.1592.79±5.21实验1组(n=3)54.32±4.39*56.26±6.14*实验2组(n=3)24.59±5.01*#30.92±4.81*#F值74.25698.962P值<0.001<0.001

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与实验1组相比。

2.3 细胞凋亡率对比

处理后24 h、48 h，实验2组与实验1组的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，实验2组也高于实验1组(P<0.05)。见表3。

表3 三组处理后不同时间点的细胞凋亡率对比

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与实验1组相比。

2.4 细胞迁移情况对比

转染48 h后，实验2组与实验1组的迁移距离与过膜细胞数都显著少于对照组(P<0.05)，实验2组显著少于实验1组(P<0.05)。见表4。

表4 三组处理后的细胞迁移与侵袭情况对比

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与实验1组相比。

3 讨论

NSCLC对人们健康的威胁日益严重，其发生、发展和侵袭转移是一个涉及多因素、多过程、多步骤的复杂漫长过程，抑癌基因的缺失或表达失调是NSCLC发生与发展的主要原因之一。当前，虽然治疗方法与药物不断推陈出新，但患者的5年生存率依然没有显著提高。因此，寻找影响NSCLC发生与发展的分子标志物，对早期诊治NSCLC具有重要的价值。

lncRNA ANRIL是一类长度≥200 nt的RNA，在核内运输、染色体修饰、转录沉默、转录激活等方面均具有重要的功能[8]，作为一类新型的具有生物学功能的临床标志物，其具有非常广阔的临床应用前景，对疾病的发生、发展及治疗有重要作用。已有研究[9]显示，在胃癌细胞中发现lncRNA ANRIL异常高表达，并且与肿瘤大小、细胞分化和胃癌患者生存时间显著相关。特别是lncRNA ANRIL通过抑制上皮-间质转化过程调控舌鳞状细胞癌，目前关于其在胃癌中的表达水平及功能作用尚不明确[10]。丙泊酚是一种强有效的抗氧化剂，也是一种强有效的血管扩张剂和支气管舒张剂，能够抑制心肌细胞钙内流并且提高心肌细胞肌丝的敏感性。有研究[11-12]证明，丙泊酚可通过抑制ERK1/2活化的途径，从而抑制结肠癌细胞的侵袭性；还可显著抑制乳腺癌细胞的粘附、转移并诱导细胞凋亡，可辅助发挥乳腺癌的治疗作用。本研究显示，处理后24 h、48 h，实验2组与实验1组的lncRNA ANRIL表达水平、细胞增殖指数显著低于对照组，实验2组也低于实验1组，说明丙泊酚能抑制lncRNA ANRIL表达，从而抑制NSCLC细胞增殖，且浓度为1 000 μmol作用更显著，提示丙泊酚具有抗癌作用，主要是丙泊酚能通过调控多条信号通路及lncRNA的表达抑制癌细胞的生存，从而发挥抑癌作用。

NSCLC是最常见的恶性肿瘤之一，尽管传统的治疗技术不断提升，但其5年生存率依然不足15%，为此寻找新的治疗方法具有重要价值。丙泊酚是临床上常见使用的静脉麻醉药，由于具有抗神经细胞凋亡作用，从而可发挥神经保护作用。体外实验表明，在肺癌细胞中，丙泊酚可抑制癌NSCLC细胞的侵袭和迁移，引起NSCLC的化疗增敏作用[13]。本研究显示,处理后24 h、48 h，实验2组与实验1组的细胞凋亡率显著高于对照组，实验2组也高于实验1组，表明丙泊酚能促进NSCLC细胞凋亡。也有研究[14]显示，急性早幼粒细胞白血病细胞暴露于丙泊酚后，可促使凋亡小体的形成，导致抑制细胞生长。特别是低浓度丙泊酚可能通过促进NSCLC细胞凋亡相关蛋白Bax的表达，促进细胞凋亡；较高浓度的丙泊酚可能通过促进凋亡蛋白酶Caspase-3的表达，也可促进细胞凋亡。但是，高浓度的促进凋亡效果显著，说明高浓度的丙泊酚可以同时作用于多条凋亡信号通路来促进NSCLC细胞凋亡。

异常表达的lncRNAs对NSCLC的发展发展起重要的调控作用。lncRNA ANRIL可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进NSCLC的发展过程。lncRNA ANRIL还通过调节miRNA信号通路诱导EMT，从而促进肝癌细胞的侵袭转移。本研究显示转染48 h后，实验2组与实验1组的迁移距离与过膜细胞数都显著少于对照组，实验2组也显著少于实验1组，表明丙泊酚减弱了细胞的侵染和转移能力，抑制NSCLC细胞的迁移。不过丙泊酚对NSCLC的调控作用是一个多因素多步骤的过程，除了转录因子外，miRNA、组蛋白修饰、DNA甲基化、核苷酸

糖代谢位等因素都可能在其中发挥了相应的作用[15]。同时本研究也有一定的不足，丙泊酚与lncRNA ANRIL更深入的功能及潜在的分子机制仍不明确，对相关的信号通路分子，蛋白分子没有研究，需进一步探索。

综上所述，丙泊酚能通过抑制lncRNA ANRIL的表达，从而抑制NSCLC细胞增殖与迁移，促进其凋亡，从而发挥抑癌作用。