不同保护剂对纤维分解菌冷冻保存活性的作用

任清长 郁冯艳 付佳伟 华金玲

摘 要：目的：添加甘油、蔗糖、葡萄糖、蛋黄作为纤维分解菌冷冻干燥的保护剂，筛选最有利于纤维分解菌冷冻干燥保存的保护剂，为优化纤维分解菌冷冻干燥低温保存保护剂提供参考。方法：添加甘油、蔗糖、葡萄糖、蛋黃作为4个试验组，添加量均为10%，每个试验组3个重复，同时设置1个不含保护剂的空白对照组。预冻时间设为12h和24h，采用羧甲基纤维素钠半固体培养基与稀释至107级的菌悬液混匀的方法培养冷冻干燥处理前后的纤维分解菌，37℃培养12h，观察处理前后每个培养皿中单个菌落数并计数。结果：预冻时间为12h，甘油处理组、空白对照组与蛋黄处理组、葡萄糖处理组、蔗糖处理组间差异极显著（P<0.01），甘油处理组与空白对照组间差异显著（0.05>P>0.01）;预冻时间为24h，蔗糖处理与空白对照组间差异显著（0.05>P>0.01），蛋黄处理与蔗糖处理、甘油处理、空白对照组间差异极显著（P<0.01）。结论：预冻时间为12h和24h，均以蛋黄处理组的复活率最高，不加保护剂的复活率最低。随着预冻时间的延长，每个不同处理组的复活率都有所减小。预冻时间12h，蛋黄处理组的复活率在试验中最高，保护效果最好。

关键词：纤维分解菌;保护剂;预冻时间;复活率

中图分类号 S476文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）16-0025-04

Abstract：Objective the purpose of this study is to add glycerol，sucrose，glucose，egg yolk as cellulose decomposition microbes freeze-drying protectant，searching for the most in favor of preservation of cellulose decomposition microbes freeze-drying protectant，to optimize the screening of cellulose decomposition microbes freeze-drying kept at low temperature protective agent to provide the reference.Methods Add glycerol，sucrose，glucose，egg yolk，as four patients，content are all 10%，each group sets three repeats，setting up a blank control group without protective agent，at the same time.prefreezing time set to 12 hours and 24 hours，using sodium carboxymethyl cellulose semisolid culture medium with bacteria suspension diluted to level 107 blending method of training before and after freeze-drying process of cellulose decomposition microbes，developing 12 hours in 37℃.Observe individual colony forming units of each group before and after dealing and count..ResultsUse the semisolid colony counting method to measure the solid medium prefreezing time of 12 hours glycerin treatment group，blank control group with egg yolk treatment group，glucose，sucrose extremely significant difference between groups（P<0.01），glycerin significant difference between treatment group and the blank control group （0.05>P>0.01）.Prefreezing time for 24 hours cane sugar processing and significant difference between the blank control group （0.05>P>0.01），the egg yolk with sucrose，glycerol，and extremely significant difference between the blank control group （P<0.01）.Conclusion Prefreezingtime of 12 hours and 24 hours，the resurrection rate of the egg yolk treatment group is the highest，the resurrection rate without protective agent is the lowest.The resurrection rate of each treatment group decreases with the increasing of the prefreezing time.Prefreezingtime of 12 hours，the resurrection rate of the egg yolk treatment group is the highest in this study.Thus，the protective effect of egg yolk is the best in four protective agents.

Key words：Cellulose decomposition microbes;Protective agent;Prefreezing time;Resurrection rate

秸稈不仅是农作物的主要副产品，也是十分宝贵的生物资源[1]，如果不合理利用，将会造成资源浪费，甚至有会造成环境污染，若利用合理，则变废为宝，实现秸秆的经济、环境及社会效益[2]。秸秆当中所含的主要营养物质是粗纤维，由于很难被动物消化，因而主要饲喂牛羊。纤维分解菌分泌的纤维素酶，能够有效地降解秸秆中的木质纤维素并转化成葡萄糖，从而能够被动物机体所吸收[3]。将生物活性强的纤维分解菌添加到秸秆当中制成发酵饲料，秸秆就能够更好地为反刍动物所消化吸收，从而充分地利用了秸秆资源，提高了饲料资源的利用效率，降低环境污染的程度。但纤维分解菌用于制作秸秆发酵饲料，也存在着活菌如何长期保存以便发酵饲料生产的问题。

据国内相关研究报道，用于保存菌种最有效的方法是真空冷冻干燥法[4]，为了避免菌种在冷冻干燥过程中受冷冻和干燥2种刺激的作用[5]，必须添加有效的保护剂来承受这2种刺激的损害，降低对菌体细胞的破坏，而且复水[6]后还具有较高的降解纤维素的能力。为此，本试验通过添加蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黄4种不同的保护剂，研究各自对纤维分解菌冷冻干燥的作用，从而筛选出最有利于纤维分解菌冷冻保存的保护剂，以期为优化纤维分解菌冷冻干燥保存中保护剂提供参考，为纤维分解菌发酵饲料的生产工艺研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品及菌种 脱脂乳粉、蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黄、羧甲基纤维素钠半固体培养基、1株纤维分解菌（实验室保留的菌种）。

1.2 试验设计 添加蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黄4种保护剂，添加量均为10%，每种保护剂做3个重复试验组，同时设定1个不加保护剂的空白对照组。将羧甲基纤维素钠半固体培养基与处理前后稀释至107级的1mL菌液稀释液，在50℃条件下混匀，37℃培养12h，观察生成的单个菌落数。用处理后的单个菌落数除以处理前单个菌落数的方法计算出每种保护剂的复活率，用复活率值的大小来评价每种保护剂的作用。

1.3 试验方法

1.3.1 纤维分解菌的纯化、筛选和鉴别 （1）实验室保留的纤维分解菌经初筛后，改用羧甲基纤维素钠复筛培养基[7]分离纯化，刚果红培养基鉴别，挑取透明圈内的单个菌落，再次接种到复筛培养基上进行纯化。反复纯化过后的菌种经革兰染色，镜检观察，结果被染成蓝紫色，菌体呈短杆状，可初步判定为纤维分解菌。（2）纤维分解菌的形态学观察：详见图1、图2。

1.3.2 纤维分解菌菌悬液的制备 （1）脱脂乳的制备：从网上购买进口新鲜的脱脂乳粉，按照脱脂乳粉∶蒸馏水=3∶22的比例配成12%的脱脂乳。（2）菌悬液的制备：接种环挑取3～4个生长良好的纤维分解菌平板，接到100mL灭菌后的脱脂乳中。将接好菌的脱脂乳置于28℃恒温振荡培养箱中，培养摇晃过夜制成生长均匀的菌悬液。

1.3.3 处理前菌悬液活菌数的测定

1.3.3.1 处理前菌悬液的稀释 （1）取出振荡过夜的菌悬液，放在灭菌后的无菌操作台上，用移液枪分别从菌悬液的上、中、下3层取出10ul菌液。（2）每层取出的菌液均加到装有10mL生理盐水的管子中，上下颠倒管子使其混合均匀。再取混合好的稀释液10ul到另1个10mL生理盐水管子中，混匀。（3）取混匀后的稀释液1mL，加到9mL生理盐水的管子中，混合均匀，将原菌悬液稀释至107级。

1.3.3.2 羧甲基纤维素钠半固体培养基 Na2HPO41.25g，KH2PO40.75g，CMC-Na10g，酵母提取物0.25g，蛋白胨1.25g，琼脂条2.5g，蒸馏水500mL，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

1.3.3.3 稀释后菌悬液的接种与培养后菌落计数 （1）移取最终的原菌液稀释液1mL，加在培养皿底部，轻轻摇晃平皿，让稀释液均匀地铺满整个培养皿的底部。（2）待半固体培养基灭菌后冷却至50℃以下时，开始往平皿底部倒入适量半固体培养基。用移液枪的枪头顺时针搅拌使其混合均匀，并防止气泡产生而影响观察。混合均匀后，放在37℃恒温培养箱中培养12h。（3）观察培养后的平板中目标菌的菌落生长情况，并记录下每层所生成的单个菌落数，取其平均值作为处理之前10μL原菌液当中的活菌数。

1.3.4 原菌悬液冻干保护剂的添加 （1）安瓿管及保护剂的预处理：安瓿管先用1%的盐酸浸泡30min，再用清水洗净，经121℃高压蒸汽灭菌20min后，置于烘箱中备用。蔗糖、葡萄糖固体药品按量称好后开紫外灯杀菌10min，甘油进行121℃高压蒸汽灭菌处理，选用新鲜且无任何病原菌的鸡蛋，取出蛋黄打均匀后，开紫外灯杀菌10min。（2）固体保护剂的添加：称取预处理好的蔗糖、葡萄糖各0.05g，移液枪吸取菌液0.5mL，在紫外线照射过的塑料手套上混合后，加入到安瓿管中，并塞进灭菌的脱脂棉。（3）液体保护剂的添加：甘油和蛋黄都取50μL，同上与菌液混合均匀后，加到安瓿管中，塞好脱脂棉。

1.3.5 试样的冷冻干燥保存 （1）试样的预冻处理：装好保护剂与菌液的安瓿管试样，连同不加保护剂的空白样共同放在一个无菌的自封袋中，置于-80℃冰箱中做预冻处理。（2）试样的冷冻干燥：①冷冻干燥机用前开机预冻30min，待冷肼内的温度达到-55℃后，将样品放在物料盘上，加入1支氯化钴指示剂，盖好有机玻璃罩，打开真空泵，进行抽真空，时间为18～20h。②待氯化钴指示剂由红色变成蓝色时，判定样品中的水分已干。此时可观察到样品已成干粉状，即关闭真空泵，关闭干燥机电源，打开玻璃罩，将样品取出。（3）封管：用坩埚钳夹住安瓿管的球形底部，镊子夹住管头，将管子的细部置于酒精喷灯火焰上。让其烧断，并用镊子夹瘪烧断处，使其成鸭嘴状便可。（4）保存：封管后的样品放到-80℃冰箱中，进行长期低温保存。

1.3.6 菌冻干粉的复活 （1）菌冻干粉的复活：①将保存在-80℃冰箱中的冻干粉样品取出，放进一个铁试管架上，在操作台上静置5min。②小心地敲碎封管口，用移液枪吸取500μL的灭菌蒸馏水，加入到每支管中，手腕轻轻摇动，直至冻干粉溶解成液态，达到冻干前体积。③待所有管子加完蒸馏水后，再次塞好脱脂棉，静置复活1～2h。（2）复活后菌液的稀释与培养：①用移液枪从每支安瓿管中取出10μL菌液按处理前菌液的稀释方法进行稀释，最终稀释好的样品做好相应的标记。②按照处理前与羧甲基纤维素钠半固体培养基混匀的方法对其进行接种，待其凝固后倒扣平板，在37℃培养箱中同样培养12h。③等到培养时间完成，进行菌落形态的观察，数出每个平板当中的单个菌落数，对应上每种保护剂，并做好记录。（3）根据下面公式计算出纤维分解菌冷冻干燥后的复活率：

复活率（%）=[处理后10μL菌液稀释培养生成的单个菌落数处理前10μL菌液稀释培养生成的单个菌落数]×100

1.4 数据处理 数据采用Excel和SPASS 19.0软件进行处理，并进行Duncan法多重比较。结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 保护剂对纤维分解菌冷冻干燥的影响 从表1可以看出，当预冻时间为12h，甘油处理组、空白对照组与蛋黄处理组、葡萄糖处理组、蔗糖处理组间差异极显著（P<0.01），甘油处理组与空白对照组间差异显著（0.05>P>0.01），蛋黄处理组与葡萄糖处理组、蔗糖处理组间差异不显著（P>0.05）。其中，添加蛋黄处理组的复活率最高，不加保护剂处理组的复活率最低。葡萄糖处理组、蔗糖处理组比蛋黄处理组的复活率都低13.3%;甘油处理组比蛋黄处理组、葡萄糖处理组、蔗糖处理组的复活率分别低50.0%、42.4%、42.3%;空白对照组比甘油处理组的复活率低46.8%，不同处理组间的复活率由高到低的顺序为蛋黄>葡萄糖>蔗糖>甘油>空白对照组。预冻时间为24h，蛋黄处理与葡萄糖处理组，葡萄糖处理与蔗糖处理、甘油处理组，甘油处理与空白对照组间差异不显著（P>0.05），蔗糖处理与空白对照组间差异显著（0.05>P>0.01），蛋黄处理与蔗糖处理、甘油处理、空白对照组间差异极显著（P<0.01）。处理组间仍以蛋黃的复活率最高，不加保护剂的最低，且不同处理组间的复活率由高到低的顺序仍与12h的相同。

2.2 预冻时间对纤维分解菌冷冻干燥的影响 从表1可以看出，蛋黄处理组、甘油处理组预冻时间12h与24h的复活率差异不显著（P>0.05），葡萄糖处理组、空白对照组预冻时间12h与24h的复活率差异显著（0.05>P>0.01），蔗糖处理组预冻时间12h与24h的复活率差异极显著（P<0.01）。24h的蛋黄处理比12h的处理复活率降低了26.7%，其他处理组24h与12h的复活率相比均有所降低。其中以蔗糖处理组的复活率下降最大，24h的复活率较12h的降低55.9%。

3 讨论

3.1 保护剂 舒志全等研究蛋黄和海藻糖在人类精子冷冻保存中的保存作用时发现，蛋黄与海藻糖组合作为保护剂时，能够对精子起到更好的保护作用[8]。蛋黄不仅能减少精子细胞在预冻降温过程中受到的损伤，同时还能作为大分子物质，在冻干过程中提供框架结构，形成多孔介质。蛋黄作为保护剂，特别是深低温冷冻保存中具有极高的保护作用[9]。试验预冻时间12h和24h的不同处理组间，蛋黄作为保护剂时，其复活率都是最高的。这可能是由于蛋白质作为大分子物质，与菌体表面的自由基结合形成氢键以取代水，从而减少了游离水的含量，提高菌液的粘性，减缓了冰晶生长的过程，使冰晶变得细小，因此就起到了保护菌体细胞的作用[10]。脱脂乳粉主要是在细胞表面起保护作用，需要和其它类型保护剂混合使用效果才更好，甘油能够渗透到细胞内部，使细胞壁的通透性降低，从而对细胞起到很好的保护作用[11]。试验脱脂乳的空白对照组在所有的处理组间复活率最低，预冻时间12h甘油处理组与空白照组间的复活率差异显著（0.05>P>0.01）。此试验的结果与相关研究的规律基本符合。蒲丽丽等研究中提到糖类物质具有大量羟基，能联结菌周围的自由基团，可避免菌暴露在介质中[12]。因此，蔗糖处理组与葡萄糖处理组的复活率都很高，接近40%;这与吴玲等在研究瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择时，蔗糖处理组的复活率44%接近，但其葡萄糖处理组的复活率高达75%，显著高于此试验中葡萄糖处理组的复活率[13]。可能是本试验在葡萄糖的添加量上与之有所差别，或者是葡萄糖本身的品质较差所致。

3.2 预冻时间 张帆等在对双歧杆菌冻干菌粉制备工艺的研究中发现，当预冻温度一定时，随着预冻时间的增加，细菌的存活率整体呈下降的趋势[14]，试验预冻时间12h，不同处理组的复活率都较24h的复活率高。这可能是因为预冻时间过长，低温进一步破坏了保护剂，使得其保护效果下降。张志平等研究中提到冷冻平衡时间的延长，精子的活力呈下降趋势，以冷冻前平衡1h为宜[15]，这与试验结果基本吻合。Zindl等在冷冻狼精液中发现，以平衡1h为宜，平衡时间过长会损害精子的完整性[16]。试验预冻时间24h各处理组的复活率要显著低于12h的，说明预冻时间不应过长，而最佳的预冻时间可能介于12～24h，或者低于12h。这就需要设置多个预冻时间梯度，找出最佳的预冻时间，从而提高纤维分解菌冷冻干燥的复活率。

4 结论

本试验结果表明，蛋黄、蔗糖、葡萄糖、甘油4种保护剂在纤维分解菌冷冻干燥过程中均具有显著的保护作用。预冻时间为12h和24h，均以添加蛋黄处理组的复活率最高，不加保护剂处理组的复活率最低。随着预冻时间的延长，各处理组的复活率均有所下降，其中蔗糖处理组的复活率下降最显著。预冻时间以12h时，蛋黄处理组的复活效果最好，因此，4种保护剂中保护效果最好的是蛋黄。

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（责编：张宏民）