高粱自然发酵对淀粉分子结构及老化性质的影响

葛云飞，康子悦，沈 蒙，王 娟，全志刚，肖金玲，王维浩,2，曹龙奎,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

高粱属于禾本科高粱属，又名蜀黍、高粱米，芦栗等[1]，因其高产性和高抗逆性及其在制糖、发酵食品、饲料及生物燃料等方面用途广泛而被大量种植[2-3]，由于高粱具有凉血、解毒之功效，因此常吃高粱食品，不仅可缓解积食等消化不良症，还可预防多种疾病[4]。

淀粉为高粱中主要的碳水化合物，质量分数约为60%～70%，高者可达80%左右，因此淀粉的理化性质直接影响到高粱的食用品质及老化性能，生活中因高粱的口感较粗糙，适口性较差而不易被消费者所接受，在以往的文献报道中通常采用发酵、发芽和化学处理改善高粱的食用品质，扩大其应用范围[5]，在西方国家通常将高粱进行发酵生产断奶粥、高粱发酵饮料[6]、高粱面包等[7]。在目前发酵高粱的研究中主要集中在探讨高粱消化率的大小、淀粉的理化性质[8]及发酵菌株的鉴定与筛选[9]，而对于自然发酵后高粱淀粉的分子结构及老化性能涉及较少，由许永亮等[10]研究可知，淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的高分子化合物，其中淀粉的凝胶特性、流变特性、热特性及颗粒形态不仅与淀粉分子结构有关，还受分子质量分布情况的影响，所以只有进一步研究发酵高粱淀粉的分子结构及其理化性质，才能扩大高粱的应用范围。

因山东临沂R高粱的直链淀粉含量较高，更易老化，因此将其作为研究对象，本研究将高粱进行发酵0～15 d，探讨不同发酵时期高粱淀粉的分子结构、颗粒形态及高粱淀粉的老化性能指标，并与未发酵高粱淀粉作对比，通过发酵处理提高高粱的老化性能，使其适用于生产米粉、粉丝等产业化生产，提高其利用率，并为高粱淀粉的应用提供理论基础与数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱为山东临沂R高粱；盐酸、氧化钠（均为分析纯）、溴化钾（光谱级） 天津市大茂化学试剂厂；葡聚糖标准 美国Sigma公司；蒸馏水为实验室自制。

1.2 仪器与设备

Dgg-9053A型电热鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；MJ-10A型磨粉机 上海市浦恒信息科技有限公司；RVA4500型快速黏度分析仪 瑞典波通仪器公司；DSC1型差示扫描量热仪 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；TAQ2000国产高压不锈钢坩埚 上海瑾恒仪器有限公司；扫描电子显微镜 荷兰FEI公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；凝胶色谱-示差-多角度激光光散射仪 美国Waters公司；ICS-5000离子色谱仪 美国Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱的自然发酵

取高粱150 g，经蒸馏水水洗3 次，加入蒸馏水300 g、葡萄糖4.5 g，在30 ℃自然发酵0～15 d。

1.3.2 自然发酵高粱淀粉的制备

发酵后的高粱进行水洗，于35 ℃烘干。将干磨后过80 目筛的高粱粉按料液比1∶3（g/mL）于0.3 g/100 mL的NaOH溶液中浸提3 h，4 000 r/min离心10 min，弃上清液，除去沉淀中上层黄褐色物质，连续水洗4 次，离心直至淀粉浆呈白色为止。用1 mol/L HCl溶液调淀粉浆至pH 7.0，离心，30 ℃干燥，过80 目筛备用[11]。

1.3.3 自然发酵对高粱淀粉分子结构的影响

1.3.3.1 发酵对高粱淀粉分子质量的影响

样品处理：取10 mg淀粉样品，加1 mL 90%二甲基亚砜，100 ℃溶解过夜，加3 mL无水乙醇，离心去除上清液，沉淀经无水乙醇洗2 次，风干后加3 mL 1 mol/L NaNO3溶液（含0.02% NaN3）于121 ℃反应20 min，12 000 r/min离心10 min，取100 μL上样，样品数据用ASTRA 6.1软件分析[12]。

检测条件：流动相为0.1 mol/L NaNO3溶液（含0.02% NaN3），流速0.4 mL/min，柱温60 ℃，分析柱型号为Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-806 HQ，上样量100 μL。

1.3.3.2 发酵对高粱淀粉分子官能团的影响

取高粱淀粉0.5～2 mg，再加入100～200 mg经过磨细干燥的KBr粉末，混合研磨均匀后，放入傅里叶红外光谱仪光束中进行全波段的扫描，扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，最后得到发酵高粱淀粉的红外光谱图[13]。

1.3.3.3 发酵对高粱淀粉分子链长分布的影响

称取已纯化淀粉2 mg，先用500 μL 95%乙醇溶液重悬，再加4.5 mL去离子水，沸水浴60 min，间断涡旋混匀，取2.5 mL的糊化样品，加入10 μL（1 000 U/μL）异淀粉酶脱分支。样品600 μL每管进行分装，在室温下真空干燥。溶解后取25 μL样品注射入配置有二极管阵列检测器和PA-1色谱柱的ICS5000中。淋洗速率0.5 mL/min。不同链长所对应的峰面积用PeakNet软件进行分析。色谱条件：流动相为NaOH-NaAC，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃，色谱柱型号为PA1，上样量25 μL。

1.3.3.4 发酵对高粱淀粉结晶度的影响

X-射线衍射仪分析条件：特征射线CuKa，功率1 600 W，管流40 mV，管压4.0×104V，扫描速率4°/min，扫描范围2θ为3°～60°，步长0.02°，DS-SS-RS设置分别为1 mm-1 mm-0.1 mm[14]。利用X´pert HighScore软件进行结晶度的计算，并导出相应曲线。

1.3.3.5 发酵对高粱淀粉颗粒形态的影响

用导电胶将分散均匀的高粱淀粉样品固定，利用离子溅射镀膜仪喷金，用扫描电镜进行观察并拍摄有代表性的照片。

1.3.4 自然发酵对高粱淀粉老化性质的影响

称取3.500 g（干基）发酵及未发酵高粱淀粉于铝筒中，加蒸馏水25 mL，35 ℃保温3 min，以升温速率6 ℃/min加热到95 ℃，保温5 min，以6 ℃/min速率降温到50 ℃，用RVA4500型快速黏度分析仪分析得到老化特征值[15]。

1.4 数据统计分析

采用Excel、SPSS软件对数据统计分析，用Origin软件进行绘图处理，各数据重复测定3 次取 ±s。

2 结果与分析

2.1 自然发酵对高粱淀粉分子结构的影响

2.1.1 发酵对高粱淀粉分子质量的影响

图1 自然发酵高粱淀粉分子质量分布图谱Fig. 1 Molecular mass distribution profiles of naturally fermented sorghum starch

表1 自然发酵高粱淀粉分子质量测定结果Table 1 Molecular weight measurement of naturally fermented sorghum starch

图1为自然发酵高粱淀粉分子质量，随着发酵时间的延长高粱淀粉分子质量先降低后增加。0～14 d分子质量测定结果如表1所示，自然发酵高粱淀粉的重均分子质量（mw）低于未发酵淀粉，其中低分子质量（＜1×107Da）百分含量由未发酵的74.2%最高增加至83.1%，而高分子质量（mw＞4×107Da）部分随发酵时间的延长波动变化，其发生原因是在发酵过程中，微生物的丰富度随发酵时间的延长而增加，所积累一定的酶、有机酸类物质，其中发酵液中所积累的淀粉酶类物质，而发酵过程中产生的有机酸先作用于支链淀粉分子外侧链，使之降解生成短支链与或直链淀粉，使发酵后的高粱淀粉分子质量降低[16]，随着发酵时间的延长淀粉酶等物质进一步将直链淀粉水解成支链淀粉或短直链淀粉，分子质量小幅度增加，而在发酵后期有机酸等物质积累达到高值，使高粱淀粉的α-1,4键和α-1,6键进行水解成葡萄糖使分子质量降低。而直链淀粉比例的相对增加，可能会导致回生值增加。分散指数即mw/mn的降低表示发酵体系中的组分变得单一，分子质量分布情况逐渐简单化，发酵使淀粉中的长支链部分发生降解，形成短支链等中间组分，使支链淀粉与直链淀粉的比例相对降低，使发酵后的高粱淀粉更易老化，形成凝胶结构[17]。

2.1.2 发酵对高粱淀粉官能团的影响

图2 自然发酵高粱淀粉傅里叶红外图谱Fig. 2 FTIR spectra of naturally fermented sorghum starch

傅里叶近红外光谱因对淀粉分子构象变化敏感，可分析淀粉分子结构而被广泛应用[18]。利用红外光谱研究自然发酵过程中高粱淀粉分子官能团及化学键的变化，如图2所示，在峰1和峰3处出现的较强吸收峰为C—H面内弯曲振动，峰2处为C—O伸缩振动吸收峰，峰4处为C＝O伸缩振动吸收峰，峰5处为C—H伸缩振动吸收峰，峰6处为O—H伸缩振动吸收峰。Park等[19]研究发现，淀粉分子在1 022 cm-1处的红外吸收代表淀粉无定形区的结构特征，在1 047 cm-1处的红外吸收代表淀粉分子结晶区的结构特点，而由图2可知不同发酵时间的淀粉分子在结晶区和不定型区的敏感程度较小。在本研究中4 种不同发酵时间淀粉样品的红外吸收光谱峰形没有明显差异，没有新吸收峰的出现，但是吸收峰强度在一定程度上发生变化，其中吸收峰强度大小顺序为发酵3 d＞发酵8 d＞发酵0 d＞发酵14 d。因此发酵过程中未产生新的化学键或者基团，未破坏淀粉的分子的基本结构。

2.1.3 发酵对高粱支链淀粉链长分布的影响

支链淀粉的聚合度，即为支链淀粉链的长度，通常以脱水葡萄糖基元的个数表示[20]。根据Jaiswal等[21]研究可知支链淀粉的链长分布、分支簇及其排列的不同直接影响着淀粉的颗粒形态及理化性质，并最终导致物种间、品种及组织间淀粉的功能性质差异。

支链淀粉通过异淀粉酶去支化，并利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测发酵前后高粱支链淀粉的链长分布情况，由表2可知，发酵前后的支链淀粉链长分布显著变化，其中发酵使短支链淀粉即聚合度分布在DP 6～24的含量较未发酵的降低1.8%～3.89%，长支链淀粉即聚合度分布在DP不小于60的含量较未发酵长支链淀粉含量高0.9%～2.01%，其发生原因是随着发酵时间的延长，发酵底物有机酸和淀粉酶的积累，先作用于支链淀粉最外侧非还原性末端，使支链淀粉的外侧短支链进行降解，使其含量降低，长支链淀粉含量相对增加，使大分子长支链淀粉得到纯化，平均聚合度增加。

表2 自然发酵对直链淀粉链长分布的影响Table 2 Effect of natural fermentation on amylose chain length distribution

2.1.4 发酵对高粱淀粉结晶度的影响

图3 自然发酵高粱淀粉的X-衍射图谱Fig. 3 X-diffraction pattern of naturally fermented sorghum starch

由图3可知，自然发酵前后高粱淀粉峰形没有改变，仅衍射强度发生一定变化，表现仍为典型的A型结晶结构，发酵高粱淀粉均在2θ为15°、17°、18°、23°处有特殊衍射峰（峰序号1～4），即发酵未改变高粱淀粉的晶型，只改变了淀粉的特征峰的衍射强度。淀粉为部分结晶物，包括结晶区、部分结晶区及非结晶区，其中非结晶区为短程有序，长程无序的区域，主要由直链淀粉构成，且呈明显的弥散衍射特征；部分结晶区及结晶区域为晶粒粒度较大且完整有序的结构，由支链淀粉构成[22-23]。

表3 自然发酵高粱淀粉X-衍射2θ角和峰宽Table 3 X-diffraction angle and peak width of naturally fermented sorghum starch

由表3可知，通过不同发酵时间的处理，高粱淀粉的结晶度发生变化，较未发酵高粱淀粉结晶度增加1.94%、1.3%和1.96%，在自然发酵过程中优势菌代谢产生的有机酸或酶类物质作用于淀粉结构较松散的非结晶区，使无定型区即非结晶区遭到削弱或破坏，直链淀粉溶出，回生值增加，而由于淀粉结晶区中糖构象的固定化以及淀粉链的紧密结合使H3O+不容易渗透到淀粉结晶区内部[24]，但会使结晶区较外侧的短支链淀粉降解，支链淀粉的短支链聚合度降低，使淀粉分子的结晶区比例相对增加，即发酵使淀粉的结晶度增加。

2.1.5 发酵对高粱淀粉颗粒表面形态的影响

图4 自然发酵高粱淀粉颗粒形态Fig. 4 Observation of naturally fermented sorghum starch granules

由图4可以看出，高粱淀粉颗粒多数为不规则球体，表面内凹，少数表面为类蜂窝状结构[25]。通过不同时间的发酵处理与未发酵淀粉进行对比可知发酵后的淀粉颗粒表面有较明显的被腐蚀的空洞，颗粒形状不完整，颗粒表面的小颗粒淀粉比例增加，说明发酵过程中产生的有机酸、酶类物质使淀粉分子发生一定程度的降解，使直链淀粉从颗粒内部溶出。在发酵14 d时，淀粉颗粒形态较光滑，大小形状较均一，而颗粒均匀的淀粉是获得良好凝胶性能的重要因素之一[26]，因此此时的高粱淀粉较适合生产米粉等老化特征较明显的产品。

2.2 自然发酵对高粱淀粉老化性质的影响

Aggarwala等[27]研究发现RVA老化特征曲线特点与原料颗粒形态、粒径、相对分子质量、直链淀粉与支链淀粉的比例有关。高粱在一定温度、加糖量的条件下进行自然发酵与未发酵高粱淀粉的老化特征值比较，如表4所示，与未发酵高粱淀粉相比，峰值黏度和衰减值先增加后降低，最终黏度及回生值升高，凝胶强度增加，结论与袁美兰等[28]研究结果相同。

淀粉分子以葡萄糖聚合物的形式存在，包埋于高粱颗粒中的蛋白球体中，此时颗粒的空间位阻较大，抗剪切能力增强，通过自然发酵处理，所产生的有机酸、酶等物质降解高粱中的蛋白质与脂肪，使淀粉分子充分暴露，吸水膨胀，因此峰值黏度增加，随着发酵时间的延长，有机酸、酶类物质的不断积累，使高粱的支链淀粉发生降解断链或脱支，使支链淀粉的平均聚合度和平均链长降低，因此发酵后期淀粉分子的峰值黏度降低，而通过Camargo[29]、Chang[30]、Han[31]等研究可知支链淀粉的长链含量与衰减值呈高度正相关，因此发酵使衰减值增加。回生值揭示淀粉糊冷却过程中直链淀粉形成凝胶的能力或老化的趋势，反映了淀粉冷糊的稳定性和老化趋势，自然发酵使高粱淀粉的回生值增加，其原因发酵使高粱中的溶出的直链淀粉分子含量增加[32]，随着发酵时间的延长，淀粉分子内部结构发生变化，分子间的氢键发生断裂，淀粉分子由有序晶体向无序晶体转化。

表4 自然发酵对高粱淀粉老化性质的影响Table 4 Effect of natural fermentation on retrogradation properties of sorghum starch mPa·s

3 结 论

高粱自然发酵0～15 d，探讨发酵过程中淀粉颗粒形态、分子结构及老化性质的变化规律，通过与未发酵淀粉进行对比可知：发酵使淀粉颗粒表面发生侵蚀形成孔洞，而利用红外光谱检测可知发酵后未形成新化学键及化学结构，但使高粱淀粉的mw降低，低分子质量物质的增多及高分子物质的减少，说明发酵使长支链淀粉分子发生降解，生成短支链或直链淀粉，有利于淀粉分子聚集形成致密有序化结构进一步形成凝胶，因此发酵使淀粉的回生值增加，糊化温度热晗值降低。本研究不仅通过不同角度探讨发酵对淀粉分子的影响机理，还通过控制发酵条件生产老化高粱产品如粉丝等，进一步扩大高粱的应用范围，提高其应用价值。