脂肪添加量对发酵香肠脂质和蛋白质氧化及挥发性化合物形成的影响

扈莹莹，王 妍，于 晶，蒋培宇，孔保华，陈 倩,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.岛津企业管理（中国）有限公司，辽宁 沈阳 110000）

发酵香肠因其良好的口感和独特的风味而受到消费者的喜爱，脂质是众多脂肪酸和脂溶性维生素的主要来源，也是发酵香肠生产中重要的原材料之一，会直接影响香肠的硬度、多汁性和风味等感官特性[1]。在发酵过程中脂质会发生氧化，适当的脂肪添加量有利于风味的形成。一方面，适度的脂质氧化会产生小分子挥发性化合物，赋予产品特有的风味；另一方面，脂质是风味物质的溶剂，蓄积风味物质或者作为风味物质反应场所[2]。然而，脂质的氧化也是肉及肉制品品质劣变的一个主要原因，它会导致风味变差、失去良好的质构特性和色泽，造成营养物质损失等，进而影响消费者的接受程度[3]。另外，脂质氧化也会促进蛋白质的氧化进程，蛋白质会发生羰基化、降解以及聚集等修饰作用。这些修饰会改变蛋白质的溶解性和功能性，进而降低消化率，破坏凝胶性、乳化性和保水性，并且产生的羰基化合物也会影响产品风味[4]。可见，脂肪的添加量对肉及肉制品品质有重要的影响。

传统的香肠脂肪添加量为20%及以上，高脂肪含量在提供良好口感及风味的同时也会加速脂质氧化进程，造成产品品质劣变，并且高脂的摄入会产生高血压、肥胖和心血管病等慢性疾病[5]。随着人们健康理念的增强，降低香肠中的脂肪添加量势在必行。目前，低脂处理通常采用脂肪替代物和直接减脂的方式，通过添加菊粉、谷物和水果纤维以及短链低聚果糖等替代香肠中的脂肪[6]，也有研究直接减脂对香肠的理化性质的影响[1]。然而，低脂对接种发酵香肠的脂质和蛋白质氧化情况却鲜有研究。本研究采用直接减少脂肪添加量的方法，考察不同脂肪添加量对发酵香肠理化特性及挥发性化合物的情况，通过感官评价确定适当的脂肪添加量。揭示发酵香肠在发酵过程中品质变化的本质，为开发低脂发酵香肠提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后腿肉、背部脂肪 市购；亚硝酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖、食盐、谷氨酸钠（均为食品级） 天津市福晨化学试剂厂；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2,4-二硝基苯肼、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 美国Sigma公司；其他所用化学试剂均为国产分析纯。

弯曲乳杆菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌从发酵风干肠中分离，保存于东北农业大学食品学院畜产品加工研究室。

1.2 仪器与设备

HWS-70BX恒温恒湿箱 天津市泰斯特仪器有限公司；GC-3L小型灌肠机 瑞安市鸿飞机械有限公司；SPX-250B-D型振荡培养箱 上海博讯实业有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；GCMS-QP2020单四极杆型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵香肠的制备

根据Olivares等[7]的方法制备发酵香肠，并作适当修改。本实验共制备4 组香肠，背部脂肪添加量分别为5%、10%、15%和20%。原料肉经修整后，瘦肉部分用筛孔为1.5 cm的绞肉机绞制，肥肉切成1 cm3的立方块，按照实验设计将肥瘦肉混合均匀，按照配方进行拌馅：亚硝酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖、食盐和谷氨酸钠添加量分别为0.15、0.5、25、25 g/kg和1.5 g/kg。然后，将制备好的发酵剂（弯曲乳杆菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌，浓度复配比为1∶1∶1）以107CFU/g接种于发酵香肠中。经充分搅拌后采用猪小肠衣灌肠，肠体直径为2.5 cm左右即可。灌制的香肠置于温度为（20±2） ℃进行风干2 d，然后移至温度为（20±2） ℃、相对湿度为75%～80%的发酵室内发酵13 d，分别在第0、5、10天和第15天取样，进行相关指标的测定，并进行3 次重复实验。

1.3.2 水分含量的测定

参照GB/T 22906.3—2008《纸芯的测定 第3部分：水分含量的测定（烘箱干燥法）》进行测定。

1.3.3 pH值的测定

参照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品 pH测定》进行测定。

1.3.4 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的测定

参照Cheng Jingrong等[8]的方法，并作适当的修改。准确称取2.5 g样品放入试管中，加入1.5 mL 1% TBARS溶液、8.5 mL 2.5%三氯乙酸-盐酸溶液，混匀后沸水浴中反应30 min，冷却，取5 mL样品加入等体积的氯仿，1 800×g离心10 min，测定532 nm波长处吸光度。TBARS值以每千克样品中丙二醛的质量表示。TBARS值计算公式如下：

式中：A532nm为溶液的吸光度；V为样品液体积/mL；M为TBARS的摩尔质量（144.15 g/mol）；m为称量样品的质量/g；l为光程（1 cm）；ε为摩尔消光系数（152 000 L/（mol·cm））。

1.3.5 肌原纤维蛋白的提取

按照Wu Mangang等[9]的方法在4 ℃条件下提取肌原纤维蛋白。

1.3.6 羰基含量的测定

参照Vossen等[10]的方法进行适当修改。取1 mL蛋白溶液（2 mg/mL）加入聚乙烯离心管中，然后加入1 mL 2,4-二硝基苯肼溶液（10 mmol/L），室温下避光反应60 min，每隔15 min振荡混匀一次。此后，加入1 mL 20%三氯乙酸溶液并离心（8 500×g，5 min）除去上清液后，将沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗涤3 次。加入3 mL盐酸胍溶液（6 mol/L），37 ℃条件下保温15 min溶解沉淀，8 500×g离心3 min除去不溶物质，最后获得物在波长370 nm处测吸光度。对照组开始时只加入1 mL 2 mol/L HCl溶液，其余操作相同。使用摩尔吸光系数22 000 L/（mol·cm）计算羰基含量，以每毫克蛋白含羰基量表示，单位为nmol/mg；同时以BSA为标准，测定蛋白质含量。

1.3.7 巯基含量的测定

参考Ellman[11]的方法，使用5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)进行测定。取1 mL肌原纤维蛋白溶液（2 mg/mL）放入离心管中，加入8 mL Tris-甘氨酸溶液（pH 8.0，1 L该溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol尿素），混匀后离心（8 500×g，15 min），收集上清液。使用摩尔吸光系数13 600 L/（mol·cm）计算巯基含量，以每克蛋白含巯基量表示，单位为nmol/g；同时以BSA为标准，测定蛋白质含量。

1.3.8 挥发性化合物的测定

按照Chen Qian等[12]的方法，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术。挥发性化合物的鉴定根据Wiley 08/NIST 08，取相似度大于900的物质作为鉴定结果，使用峰面积表示物质含量。

1.3.9 感官评定

感官评定由10 人组成，按不同实验组发酵香肠进行感官评定，采用双盲法进行检验。发酵香肠经15 min蒸制后切成3 mm的薄片，采用评分法对香肠的切面色泽、滋气味、口感和总体接受性等进行评价，每项指标最低分为1 分，最高分为7 分。分别为颜色（1=色泽暗淡，7=色泽红润）、气味（1=无气味，7=严重的刺激性气味）、滋味（1=不佳，7=极好）、酸味（1=无酸味，7=刺激性酸味）、口感（1=不佳，7=适宜）、整体可接受性（1=极差，7=极好）。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 水分含量测定结果

图1 发酵过程中脂肪添加量对发酵香肠水分含量的影响Fig. 1 Effect of fat addition on the moisture content of fermented sausage during fermentation

如图1所示，在发酵过程中，发酵香肠的水分含量呈逐渐下降的趋势，在发酵初期（0 d），发酵香肠的水分质量分数约为63.55%，发酵第15天时，脂肪添加量分别为5%、10%、15%和20%的发酵香肠，其水分质量分数分别减少至36.70%、33.95%、32.99%和31.93%，这主要由于在发酵过程中受到温度和湿度的影响，肠体内部水分的迁移和外部水分的蒸发，导致发酵香肠水分的散失。此外，发酵香肠中脂肪添加量较高的处理组，其水分含量显著降低（P＜0.05），可能由于脂肪添加量较高的处理组脂质氧化程度较大，从而促进了肌肉蛋白氧化，导致保水性降低，促进水分的流失[13]。另外，发酵初期肠体水分含量较高，利于乳酸菌的生长代谢，使得pH值快速下降，导致体系pH值接近肌肉蛋白的等电点，保水性下降，这与Lorenzo等[14]研究结果一致。

2.2 pH值测定结果

图2 发酵过程中脂肪添加量对发酵香肠pH值的影响Fig. 2 Effect of fat addition on pH of fermented sausage during fermentation

pH值是发酵香肠的重要指标之一，pH值的变化影响香肠中水解酶的活性，从而影响其蛋白和脂质水解进程，进而影响挥发性化合物的释放，对发酵香肠最终的品质产生影响[15]。如图2所示，随着发酵的进行，pH值呈不断降低趋势，这主要是由于发酵过程中乳酸菌通过分解碳水化合物产生乳酸所致。随着发酵香肠中脂肪添加量的增加，pH值呈上升趋势，脂肪添加量为5%的处理组的pH值显著低于其他处理组（P＜0.05），脂肪添加量为15%和20%的处理组之间无显著性差异（P＞0.05）。这主要是由于脂肪添加量的降低导致发酵香肠中水分的增加，易于乳酸菌等有益菌的生长，加速了发酵香肠中蛋白质等大分子的分解，促进体系产酸，增加酸度值；加之，脂质氧化产生的自由基诱发蛋白质氧化，产生羰基化合物进一步氧化生成酸类物质，也会降低体系pH值[16]。在发酵后期，各组发酵香肠pH值变化不显著，这可能由于发酵香肠体系内产生胺类物质，各处理组pH值在发酵后期略微升高，这与Gómez等[17]研究结果一致。

2.3 TBARS值测定结果

图3 发酵过程中脂肪添加量对发酵香肠TBARS值的影响Fig. 3 Effect of fat addition on TBARS value of fermented sausage during fermentation

脂质的氧化产物丙二醛可与TBARS在一定条件下发生反应，生成在523 nm波长处有吸收峰的粉红色产物。因此，可根据TBARS衡量脂质的氧化程度，如图3所示。随着发酵的进行，各组发酵香肠的TBARS值均显著增加（P＜0.05），并且随着脂肪添加量的增加，TBARS值也显著增加（P＜0.05）。在发酵初期（0 d），香肠TBARS平均值为0.36 mg/kg，发酵至第15天时，脂肪添加量分别为5%、10%、15%和20%的发酵香肠TBARS值分别增至1.58、1.95、2.14 mg/kg和2.26 mg/kg（P＜0.05）。

随着发酵的进行，香肠中的脂质也发生水解作用，增加了游离脂肪酸的释放，其中不饱和脂肪酸更易发生自动氧化，这也是发酵后期TBARS值大幅度增加的主要原因，并且脂肪添加量越高的香肠，在发酵过程中脂质越容易氧化，产生的自由基进行攻击蛋白质，氧化产生的羰基类化合物进一步氧化，进而增加醛类物质含量[18]。Jo等[19]将脂肪含量4.7%～15.8%的猪肉香肠切片后采用可渗透氧的膜包装，结果表明TBARS值也随着脂肪添加量的增加而增加；另外，Huang Li等[2]研究了不同添加量的脂肪对水饺肉馅脂质氧化的影响，结果亦表明，脂肪添加量越大，脂质的氧化程度越大。Utrera等[20]研究不同脂肪添加量的牛肉饼在冻藏过程中TBARS值的变化也得出相同的结论。

2.4 羰基含量测定结果

图4 发酵过程中脂肪添加量对发酵香肠中肌原纤维蛋白羰基含量的影响Fig. 4 Effect of fat addition on carbonyl content of myofibrillar proteins in fermented sausage during fermentation

蛋白质羰基（醛基和酮基）是肌原纤维蛋白氧化形成的，被广泛用于测定蛋白质的氧化程度。如图4所示，发酵初期（0 d），香肠中肌原纤维蛋白的羰基含量为0.35～0.45 nmol/mg，这个结果与Chen Qian等[21]研究的发酵香肠在第0天的数值接近。随着发酵时间的延长，不同脂肪添加量对发酵香肠的氧化影响逐渐显著，至第15天，脂肪添加量分别为5%、10%、15%和20%的香肠肌原纤维蛋白羰基含量分别增至1.48、1.67、1.74 nmol/mg和1.87 nmol/mg，各组香肠中的蛋白氧化程度明显增强，脂肪添加量较多的处理组也是在发酵过程中蛋白氧化最严重的（P＜0.05）。

脂质氧化产生的自由基会导致氨基酸侧链发生氧化或肽链发生断裂，其中赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和苏氨酸残基更易被氧化生成羰基化合物。丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和天冬氨酸等氨基酸的侧链在β-碳位置形成烷氧基，通过β-分裂产生α-碳自由基，释放侧链形成羰基化合物，从而使体系内羰基化合物及其衍生物含量增加[22]。由此可见，脂质氧化促进了蛋白质的氧化进程，也有研究表明脂质氧化引发蛋白质发生相似的自由基链式反应[23]，Sylvie等[24]也认为蛋白质和脂质氧化具有相同的催化剂，它们既可以单独进行，也可以相互作用，脂质氧化生成的醛基可与蛋白氧化生成的氨基进行反应形成席夫碱而使羰基含量增加。也有研究发现血红素、非铁血红素和脂肪一样能引发肌肉中蛋白氧化，绞碎的肌肉组织中释放一些助氧化剂，加之空气中的氧气也会促进碎肉的氧化[25]。Estévez等[26]报道了类似的结果，在具有不同脂肪含量的肝脏中，高脂肪含量的肝脏具有较高羰基含量。

2.5 巯基含量测定结果

肉制品中蛋白氧化会生成二硫键，进而导致巯基含量降低，这是肌肉蛋白发生氧化反应的另一个标志。由图5可知，随着发酵的进行，各组香肠中肌原纤维蛋白中总巯基含量均发生了不同程度的降低，且脂肪添加量越多的香肠巯基含量降低的程度越大（P＜0.05）。发酵初期（0 d），香肠中肌原纤维蛋白的总巯基平均含量为62.85 nmol/mg。发酵至第15天时，脂肪添加量分别为5%、10%、15%和20%的香肠肌原纤维蛋白总巯基含量分别降至51.29、49.13、45.23 nmol/mg和44.21 nmol/mg。由此可知，增大脂肪添加量会降低蛋白质巯基含量，说明脂质氧化促进了蛋白质的氧化进程，可能促进了半胱氨酸的氧化，半胱氨酸位于肌球蛋白头部的酶促反应中心，往往最易于遭受氧自由基的攻击而被氧化[27]，巯基氧化形成的二硫键导致蛋白质分子间发生交联和聚合，使蛋白质空间结构发生改变；巯基氧化也可以导致肌肉中钙蛋白酶失活或者被修饰，进而影响钙蛋白酶的活性和蛋白水解，使得蛋白质的功能特性发生变化，从而影响产品的品质特性，如增加肌肉的水分损失，降低肌肉的嫩度[28]，这与朱迎春等[29]研究的不同脂肪添加量的牛肉饼在反复冻融过程中巯基的影响效果相同。

图5 发酵过程中脂肪添加量对发酵香肠中肌原纤维蛋白总巯基含量的影响Fig. 5 Effect of fat addition on total sulfhydryl content of myofibrillar proteins in fermented sausage during fermentation

2.6 挥发性化合物

脂质水解和氧化、蛋白质降解和代谢以及碳水化合物的分解，通过美拉德反应、Strecker降解等途径产生挥发性化合物[30]。本实验研究了发酵初期0 d和经15 d发酵后的香肠挥发性物质的变化情况，如表1所示。共鉴定出6 类35 种挥发性风味化合物，戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、己醇、己酸、辛酸和相应的酯类物质以及烷烃类物质均来源于脂质的自动氧化，其中己醛是脂肪氧化的标志性产物[31]，也是重要的挥发性风味物质。醛类物质大多是由不饱和脂肪酸氧化生成，其阈值一般较低，且在脂质氧化过程中生成的速度较快，故对风味的影响较大；而酮类物质的阈值要高于其同分异构体的醛类物质，因此其对风味物质的影响不大；酸类和醇类物质则是由相应的醛类物质经氧化和还原作用形成的；酯类物质赋予产品甜味和水果味，但其作用不明显可能是因为添加的硝酸盐/亚硝酸盐对脂质氧化的抑制作用[32]；烷烃类物质来源于脂肪酸的烷氧自由基的均裂，其阈值较高，对风味影响不大，但其作为醛酮类化合物的前体物质，对风味具有潜在的促进作用[33]。此外，3-羟基-2-丁酮、乙酸和2,3-丁二醇源于微生物对碳水化合物的分解代谢作用；苯甲醛源于微生物对苯丙氨酸的代谢作用；2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮和2-戊醇则是在微生物作用下，不饱和脂肪酸发生β-氧化产生的。3-甲基丁醛是支链氨基酸在葡萄球菌属的作用下生成的；清酒乳杆菌体内的氨基转移酶将氨基酸转化为α-酮酸，这些α-酮酸是芳香活性醛、醇和羧酸的前体，促进挥发性化合物的生成[34]。

表1 经发酵后香肠中挥发性化合物含量Table 1 Identi fi cation and quantitation of volatile compounds(expressed as AU × 106extracted by HS-SPME) by GC-MS in the headspace of fermented sausages

脂质的氧化是发酵风味形成的主要途径，但过度的氧化会造成“哈败味”，影响产品的品质和感官特性。脂质水解形成大量游离脂肪酸，而后不饱和脂肪酸作为前导物质进一步氧化形成最终芳香的挥发性化合物，易氧化游离脂肪酸的形成是风味形成的关键组成部分[35]。发酵初期（0 d），发酵香肠中几乎未检测到特征性挥发性化合物，检测到的辛醛和己酸在各处理组之间均无显著性差异（P＞0.05）。经15 d发酵后，各处理组香肠发生了不同程度的氧化，相比第0天的挥发性化合物的种类和含量显著增多（P＜0.05），脂肪添加量多的发酵香肠，源于脂质氧化的挥发性化合物的含量也较多（P＜0.05），如己醛、戊醛、庚醛等，但脂肪添加量为20%与15%处理组之间基本无显著性差异（P＞0.05），与10%和5%的处理组有显著性差异（P＜0.05），可能由于接种的微生物对特征挥发性化合物的生成有促进作用，弥补了降低脂肪含量对产品风味的影响。

2.7 感官评定

如表2所示，增大脂肪添加量会降低香肠颜色、滋味和气味的得分，加重发酵香肠的酸味，但是适当的脂肪添加量会改善香肠的口感（P＜0.05）。脂肪在食品中具有一定的功能性和感官作用，适当的脂肪添加量可赋予食品良好的组织结构特性和光滑的口感。但过度的脂肪添加会加重脂质和蛋白质的氧化程度，导致肠体褪色、质地变差、营养损失，甚至产生哈败味，影响感官特性。整体而言，脂肪添加量为15%的发酵香肠的可接受性最好（P＜0.05），既满足了感官需求，也达到了低脂的健康理念。

表2 不同脂肪添加量的发酵香肠感官评定Table 2 Sensory evaluation of fermented sausages with different fat contents

2.8 主成分分析结果

主成分分析是将数据进行转换和降维处理，综合了向量分析以及相关矩阵，从而最大程度上体现不同样品之间的差异，空间分布图更好地反映各项指标之间的关系，可以通过主成分分析图上的距离表征[36-37]。本研究采用主成分分析建立脂肪添加量和香肠理化性质和品质特性之间的相关性。如图6所示，第1主成分和第2主成分方差贡献率分别为76.24%和8.75%，总方差贡献率为84.99%，可知脂肪添加量与以上理化指标和品质特性具有很强的相关性。第1主成分与羰基、TBARS值、挥发性化合物、pH值、口感之间呈正相关，与水分含量、巯基、气味、滋味、颜色呈负相关，第1主成分影响最大的是醛类物质，可见香肠的氧化程度与风味的形成呈正相关，由感官评价结果亦可知，过度的氧化会产生哈败味和不良滋味，造成滋味、气味和颜色上评分的降低，降低感官接受度；第2主成分与口感、气味、滋味、颜色、TBARS值以及酯类、酸类等呈正相关，与酸味、巯基、羰基、醇类、醛类等呈负相关，第2主成分影响最大的是香肠口感，可见香肠中的脂质和蛋白氧化程度过高，小分子化合物含量显著增加，降低香肠的口感，在感官分析结果中亦可知脂肪添加量为20%的口感显著低于脂肪添加量为15%的处理组。

图6 发酵香肠主成分分析图Fig. 6 Principal component analysis of moisture content, volatile components, sensory attributes and acceptability of fermented sausages

3 结 论

本实验研究不同脂肪添加量的香肠在发酵过程中脂质和蛋白质的氧化程度，并进行了挥发性化合物分析。结果表明，增加脂肪添加量会加快脂质的氧化水平，进而加速蛋白质的氧化进程，表现为羰基含量增加，总巯基含量降低；同时，源于脂质氧化作用产生的挥发性化合物含量也显著增加，包括醛、酮、醇、酸、酯和烷烃类化合物；最后，对不同脂肪添加量的发酵香肠进行感官评价，结果表明，脂肪添加量为15%的发酵香肠整体可接受性最佳。