传统发酵肉制品中降解生物胺菌株的筛选鉴定与应用研究

牛天娇，陈历水，孔杭如，郭永杰，马 莺

（1.哈尔滨工业大学 化工与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限公司，北京 101100；3.中粮营养健康研究院，北京 102209）

生物胺是一类含氮的低分子质量活性有机化合物，主要由特殊的生物胺脱羧酶通过转化特定的氨基酸形成对应的生物胺[1]。适量的生物胺有助于人体正常的生理功能，而过量的生物胺则会导致中毒，引起头痛、血压变化、呕吐等一系列严重反应[2]。它是影响发酵肉制品安全性的重要因素之一，目前生产上多采用低温储藏、超高压处理[3-5]和使用食品添加剂[6-7]等方法控制生物胺。这些方法能够在一定程度上减少产品中的生物胺含量，但不能降解已经产生的生物胺，且可能会抑制微生物的生长，因此不适用于发酵香肠的生产[8]。由此可见，找到有效的生物胺控制方法迫在眉睫。相比之下，利用发酵剂来控制发酵肉制品中的生物胺含量具有非常大的应用潜力，其中能够产生胺氧化酶的发酵剂因具有可以降解产品中已有的生物胺的优势而成为近年来的研究热点。有研究发现使用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）进行发酵时，生物胺的浓度下降了24%[9-10]，并且添加植物乳杆菌的剂量对总生物胺的产量影响更大[7，11]。ERKKILA S等[12]对发酵香肠的研究表明，游离氨基酸的含量是发酵过程中生物胺形成的限制性因素。TOSUKHOWONG A等[13]报道，植物乳杆菌可以显著降低泰国发酵香肠中尸胺、腐胺、酪胺和组胺的含量。SUN Q X等[14]研究了植物乳杆菌对哈尔滨香肠的影响作用，结果表明植物乳杆菌可对尸胺、腐胺、色胺、2-苯乙胺、组胺和酪胺等生物胺起到抑制作用，且与其他乳杆菌混合后起到更强的抑制效果。CAPOZZI V等[15]研究表明，26株植物乳杆菌可降解葡萄酒发酵过程中产生的生物胺，其可作为乳酸发酵剂。ZHANG Q L等[16]探讨了植物乳杆菌ZY-40对鲢鱼香肠发酵过程中生物胺的降解作用，研究发现植物乳杆菌ZY-40可降低70%以上的腐胺和尸胺，且可增加游离氨基酸的含量。

本研究对65株来源于传统发酵肉制品的耐盐、耐亚硝酸盐的乳酸菌，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行产生物胺定性定量检测，筛选出降解率最高的不产生物胺菌株。经形态学特征、生理生化特性研究，并结合16S rDNA序列分析对其进行鉴定，同时探索其作为发酵剂对发酵香肠中生物胺含量的影响作用，从而为发酵肉制品发酵剂的筛选、生产质量安全控制、营养功能提升提供理论依据。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

腊肠：分别购于成都、长沙、北京和昆明菜市场；发酵肉用发酵剂、商业用木糖葡糖球菌（Staphylococcus xylosus）：科汉森（北京）贸易有限公司；猪肉：市售。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，无水乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，吐温80 0.1%，MgSO·47H2O 0.58 g/L，MnSO·44H2O 0.25 g/L。加热煮沸溶解，调节pH值到6.8，121℃高压灭菌15 min。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加1.5%琼脂，121℃高压灭菌15 min。

营养肉汤培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，调节pH值至7.4，121℃高压灭菌15 min。

甘油培养基：脱脂乳12.0 g，水90 mL，甘油30 mL（约36 g），121 ℃灭菌15 min。

双层显色上层培养基：溴甲酚紫0.06 g，琼脂20.0 g，1 000 mL蒸馏水，pH 5.2。121℃灭菌10 min。

双层显色下层培养基：蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏5.0g，NaCl2.5g，葡萄糖 0.5g，吐温801mL，MgSO40.4 g，MnSO40.03 g，K2HPO42.0 g，柠檬酸三铵 2.0 g，CaCO30.1 g，FeSO40.04 g，VB10.01 g，磷酸吡哆醛0.05 g，琼脂18.0 g。色氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸各5.0 g，1 000 mL蒸馏水，pH 5.2。115℃高压灭菌15 min。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏（均为生化试剂）：北京陆桥技术股份有限公司；色胺、酪胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺、乙腈、丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl）（均为色谱纯）：美国Sigma公司；磷酸氢二钾、MnSO·44H2O、NaCl、NaOH、NaNO2、高氯酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；KOD-Plus高保真脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：日本Toyobo公司；DNA凝胶回收试剂盒：北京博大泰克生物技术有限责任公司；PMD 19-T Vector Cloning试剂盒、Taq酶（5 U/μL）及Buffer：宝生物工程（大连）有限公司；生化鉴定用反应管：杭州天和生物有限公司；API 20 E肠杆菌试剂条：法国梅里埃公司。

1.2 仪器与设备

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：日本TaKaRa公司；Lambda 25 UV/VIS spectrometer型分光光度计：美国Perkin Elmer公司；3K30型低温高速离心机：德国Satorious公司；SPX-250-C恒温培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；微孔过滤膜（0.22 μm）：济南赛畅科学仪器有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵肉中细菌的分离和不产生物胺菌株的筛选

称取4种市售发酵肉制品产品样品各10 g，分别加入90 mL无菌生理盐水，4℃涡旋振荡（200 r/min）1 min，离心、取上清备用。选择3个合适的梯度10-5、10-6、10-7，取10-7稀释溶液通过稀释倒平板法分别接种于含有6%NaCl、100 mg/kg NaNO2的MRS固体培养基上，37℃倒置培养24 h。挑取不同菌落形态、大小、颜色、生长位置的单菌落，以平板划线反复分离纯化，直至得到单菌落，将纯化后的单菌落进行培养保藏在甘油培养基中，每个菌株保藏3管，放置于-20℃，备用。将上述得到的菌株取一接种环接种到双层显色下层培养基上，37℃静置培养48 h后，无菌条件下，在下层培养基上倒上一层上层培养基（50℃）显色，并在5 min内记录实验结果，显紫色的为阳性（产胺菌），不变色即黄色为阴性（不产胺菌），以不接种菌株的培养基作为空白对照。选取阴性菌株作为实验菌株。

1.3.2 菌株生物胺降解能力评价

（1）菌液制备

将筛选出的不产胺菌株分别以107CFU/g的浓度接入到含50 mg/L 8种生物胺的营养肉汤培养基中，37℃静置培养48 h后，将菌液与等体积0.4 mol/L高氯酸混合，于-20℃冰箱中保存、待测，以不接种菌株的MRS液体培养基作为空白对照。

（2）柱前衍生

取上述样品菌液和空白对照各1mL，分别先加入2mol/L NaOH溶液200 μL，再加入300 μL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，然后再加入2 mLDNS-Cl溶液（含10 mg/mL丙酮），40℃水浴暗反应45 min，加入100 μL NH3·H2O终止反应，去除残留的DNS-Cl溶液。用乙腈定容到5 mL，过0.22 μm有机滤膜后装入棕色液相样品瓶待测。

（3）生物胺含量测定

准确称取色胺、酪胺、腐胺、2-苯乙胺、尸胺、组胺、精胺、亚精胺各50mg，分别用0.4mol/L的高氯酸定容至50mL，并稀释成质量浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的标准溶液。取1 mL标准溶液，柱前衍生后（方法同上），利用高效液相色谱进行测定，以生物胺含量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制8种生物胺的标准曲线，用标准曲线回归方程对样品中生物胺含量进行定量分析。

高效液相色谱条件：AgilentC18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；流速0.9 mL/min；进样量20 μL；柱温30℃；检测波长254 nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 生物胺分析的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution programs for biogenic amines analysis

1.3.3菌株的鉴定

（1）菌株的活化

取一接种环植物乳杆菌PL-ZL001接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h后，进行下一代活化，连续活化3代，备用。

（2）菌株的生理生化和形态学鉴定

对分离得到的菌株进行生理生化鉴定和形态学鉴定，鉴定标准参考《常见细菌鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》。

生长曲线测定：将活化后的菌种接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h，每2 h用分光光度计在波长600 nm处测定菌液的吸光度值（OD600nm）值，记录数据绘制生长曲线。以MRS培养基为空白对照。

pH变化曲线测定：将筛选得到的菌种接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h，每2 h用酸度计测定pH值，记录数据绘制pH值变化曲线。

（3）菌株的分子生物学鉴定

16SrDNA的分析采用菌落PCR方法进行扩增。16SrDNA序列扩增的引物为：

正向引物为F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；反向引物为R：5'-AAGGAGGTGW TCCARCC-3'。

PCR反应体系：10×Taqbuffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2.5 mmol/L 4 μL，MgCl（225 mmol/L）2.5 μL，PCR引物各5 μL，Taqplus DNA polymerase 2 μL，加灭菌双蒸水补至50 μL。

PCR反应条件为：94℃、3min；94℃、1min，54℃、1min，72℃、1 min，30个循环：72 ℃、5 min。

PCR产物与PMD19-T载体（TaKaRa）按PMD19-TVector Cloning试剂盒说明书进行连接，鉴定正确后，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测序结果提交至美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology informa tion，NCBI），用基本局部比对搜索工具（basiclocalalignment search tool，BLAST）工具与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性分析并利用MEGA 4软件中的邻接（neighborjoining，NJ）法构建系统发育树。

1.3.4 发酵香肠中生物胺的测定

（1）发酵香肠制作工艺

取猪后腿瘦肉80%、猪背脊20%进行绞碎、腌制、斩拌之后加入发酵剂和添加剂（盐2.5%（质量分数）、蔗糖0.5%，葡萄糖0.5%，亚硝酸钠0.015%，硝酸钾0.02%，抗坏血酸0.05%）灌肠，在22～25℃，相对湿度90%～95%条件下发酵3 d，然后转入10～13℃，相对湿度70%～80%环境下成熟25 d，得发酵香肠。

（2）发酵香肠生物胺含量测定

取5g发酵香肠样品，与20 mL0.4 mol/L的高氯酸混匀，冷冻离心10 min（4℃、4 000 r/min），将上清液倒入50 mL容量瓶中，将沉淀部分重复上述操作，上清液再次倒入上述50 mL容量瓶中并用0.4 mol/L的高氯酸定容。按1.3.2方法，取1 mL样液进行柱前衍生，利用高效液相色谱对发酵香肠中的生物胺含量进行测定，用氨基酸标准曲线对发酵香肠中生物胺含量进行定量分析。

1.3.5 数据分析

所有数据均为3次以上实验的平均值，采用SPSS 21.0软件对数据进行方差分析（analysis of variance，ANOVA），并进行显著性比较，若P＜0.05，则差异显著，若P＞0.05，则无显著差异。

2 结果与分析

2.1 不产生物胺菌株分离筛选

菌株产生的生物胺呈碱性，使培养基的pH值增加，指示剂溴甲酚紫从黄色变为紫色，而不产胺菌株培养基不变色。将从发酵肉制品中分离的菌株接种到双层显色下层培养基上培养48 h后，倒上一层上层培养基显色。从中式发酵肉制品中筛选出的65株耐盐耐亚硝酸盐乳酸菌中，11株表现为阴性，即倒入上层培养基后不变色（呈黄色），为不产胺菌；54株菌表现为阳性，即倒入上层培养基后变为紫色，为产胺菌。选取11株不产胺菌（分别编号为1#～11#）为研究对象进行后续研究。

2.2 菌株生物胺降解能力检测

将筛选出的11株不产生物胺的乳酸菌进行降解生物胺能力评价，结果见表2。由表2可知，11株不产生物胺的乳酸菌中大部分菌株能够选择性降解生物胺，菌株3#不具备降解生物胺的能力，菌株9#可降解8种生物胺，对色胺、尸胺的降解率分别达到了（65.64±5.21）%、（62.68±4.98）%，显著高于其他菌株（P＜0.05），对苯乙胺、腐胺、组胺和亚精胺等生物胺的降解率也显著高于其他菌株（P＜0.05）。因此，选择菌株9#并将其重新编号为PL-ZL001，进行后续实验。

表2 菌株对生物胺降解能力的比较Table 2 Comparison of biogenic amines degradation ability of different strains

2.3 菌株的鉴定

2.3.1菌株的形态学、生理生化特性鉴定

挑单菌落将菌株PL-ZL001进行培养，其菌落及细胞形态见图1。由图1A可知，菌落不透明，呈类圆形，边缘整齐；由图1B可知，菌体呈短杆状，端圆。

图1 菌株PL-ZL001的菌落（A）及细胞（B）形态Fig.1 Colony(A)and cell(B)morphology of strain PL-ZL001

菌株PL-ZL001具有耐中温的特性，在最高温度达42℃的条件下仍可生长，最适生长温度为30～37℃。此外，该菌能在pH 4.0～10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2，在0～10%NaCl的LB液体培养基均能生长，最适NaCl浓度为2%。利用法国梅里埃API鉴定系统对筛选菌株PL-ZL001进行生理生化鉴定实验，结果见表3。由表3可知，在糖类物质中，D-海藻糖、D-蔗糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-龙胆二糖、D-松三糖、D-土伦糖和D-麦芽糖等均为阳性，D-阿拉伯糖、D-棉子糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖等均为阴性，鉴定百分率为99.0%，T值为0.5，初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

表3 菌株PL-ZL001的生理生化鉴定实验结果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain PL-ZL001

续表

2.3.2 菌株的分子生物学鉴定

通过PCR扩增获得菌株9#的16S rDNA序列，所测得到的序列长度为1 450 bp，测序结果良好，通过GenBank的序列登录，将序列比较并构建发育树，结果见图2。由图2可知，将该菌株的16S rDNA序列与NCBI BLAST中的核酸库进行比对，得到菌株PL-ZL001与植物乳杆菌CP011769.1在同一分支、距离最近，因此，菌株PL-ZL001被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图2 基于16S rDNA序列菌株PL-ZL001的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain PL-ZL001 based on 16S rDNA sequences

2.4 菌株PL-ZL001生物胺降解验证实验结果

选取发酵肉制品中常用的木糖葡萄糖球菌与菌株PL-ZL001在发酵香肠中开展降解验证实验，以不添加菌种的样品为空白对照进行生物胺降解验证实验，生物胺含量测定结果见表4。

表4 添加不同发酵剂发酵香肠中生物胺含量的测定结果Table 4 Determination results of contents of biogenic amines in fermented sausages after adding different startersmg/kg

由表4可知，添加木糖葡糖球菌（Staphylococcusxylosus）与菌株PL-ZL001的产品中生物胺含量，除苯乙胺和亚精胺以外，含量均显著降低（P＜0.05），降解率结果见表5。由表5可知，与空白对照组相比，添加植物乳杆菌PL-ZL001可显著降低色胺、组胺、精胺等生物胺的含量（P＜0.05），降低幅度为10.92%～70.41%，其中以色胺降低幅度最大，为70.41%，这与之前的报道称添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）能抑制色胺和苯乙胺的产生、降低发酵香肠中生物胺的含量等结论一致，其机制可能是通过改变脱羧酶的活性来降低香肠中生物胺的含量[16-20]。

表5 木糖葡糖球菌和植物乳杆菌在发酵香肠中生物胺降解率Table 5 Biogenic amine degradation rate of Staphyloccus xyloseand Lactobacillus plantarumin fermented sausages%

3 结论

本研究从发酵肉制品中筛选出65株耐盐耐亚硝酸盐的乳酸菌，对菌株的生物胺降解能力进行定性、定量检测，从中筛选出1株降解生物胺效率最高的菌株PL-ZL001。由形态学特征、生理生化特性，并结合16SrDNA序列分析，鉴定菌株PL-ZL001属于植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）。将其作为香肠发酵剂，对发酵香肠的生物胺含量进行测定，结果表明，添加植物乳杆菌PL-ZL001可以抑制香肠中6种生物胺的积累，尤其是对毒性最大的组胺，控制效果最显著（P＜0.05）。本研究为发酵肉制品中的发酵剂筛选、开发和发酵产品的营养功能提升提供了一定的理论依据。