杀螟丹、螺虫乙酯和铜镉二元复合污染的联合毒性

殷鸿洋，赵 远，郑 义，保 聪，黄新新，丁英杰，蔡 强*

（1.常州大学环境与安全工程学院，江苏 常州 213164；2.浙江清华长三角研究院，浙江 嘉兴 314006；3.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；4.瓦赫宁根大学海洋动物生态组，荷兰 6708WD；5.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海200135）

随着工农业发展，重金属的排放和农药的使用对环境和生物造成了严重的影响。原环境保护部和原国土资源部发布的全国土壤污染状况调查公报显示，镉、铜污染物点位超标率分别为7.0%和2.1%[1]。虽然铜是生命体生长发育所必需的微量元素，但是过量的铜会对动植物体产生毒害作用，镉则有明显的毒害作用[2]。铜、镉等重金属污染一旦进入环境和生物体内则难以降解[3-4]。我国是农业大国，农药的使用量居世界第一，每年达50～60万t，最终进入环境的农药达使用量的80%～90%[5]。虽然可以使用中低毒的农药代替剧毒、高残留农药，但是低毒农药对环境中的生物仍存在毒性影响。在我国，中低毒农药杀螟丹和螺虫乙酯都是最常用的杀虫剂[6-7]，用于农业害虫防治的杀螟丹对鱼类胚胎毒性较高[8]，螺虫乙酯则会对水生生物产生不利影响[9-12]。

生态环境中常出现混合污染的情况，其中农业活动常造成重金属和农药各组分之间的相互影响，并共同作用于生物体产生联合毒性。例如草甘膦常与波尔多液共同使用以控制植物的霉病，这可能导致草甘膦和铜的复合污染[13]。耕种过程中过量使用磷肥会造成镉污染[14]，超量加入重金属到饲料中也会使动物粪便和秸秆混合的有机肥料存在重金属污染[15]。

重金属与农药的复合污染在环境中普遍存在，铜、镉与杀螟丹、螺虫乙酯的复合污染不可避免，虽然已有学者对这4种污染物的单一毒性效应和机理做了研究，但是重金属与中低毒农药联合毒性研究还很少。本试验采用费氏弧菌为受试生物，研究重金属铜、镉与杀螟丹、螺虫乙酯构成的二元混合体系的联合毒性，通过混合毒性指数法（MTI法）评价其联合毒性效应，为重金属和农药复合污染的生态风险评估和环境保护提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

费氏弧菌（Vibrio fischeri）冻干粉，菌株符合国际标准，由浙江清华长三角研究院提供，-20℃避光保存。将胰蛋白胨、酵母膏、甘油、磷酸氢二胺、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠配制成培养液，分装到50 mL的锥形瓶中，灭菌30 min。将上述培养至对数期的发光细菌分装至离心管中，4℃、5000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，收集菌体。将菌体重新悬浮于含一定浓度氯化钠和脱脂牛奶、蔗糖等保护剂的溶液中，分装于安瓿瓶中，每瓶0.5 mL，于-70℃预冻3 h，真空冷冻干燥24 h后封口。

Cu（NO3）2浓度为 1000 mg·L-1；Cd（NO3）2浓度为1000 mg·L-1；ZnSO4·7H2O纯度为99.5%；杀螟丹农药标准物质纯度为98.1%；螺虫乙酯标样纯度为99.0%；NaCl和丙酮均为分析纯。如无特殊说明，以上试剂均采用去离子水稀释。

细胞培养板（WHB-24），美国康宁公司；微孔板型多功能检测仪（E7031），美国普洛麦格公司。

1.2 实验方法

用1 mL 2%NaCl溶液复苏费氏弧菌冻干粉，复苏至发光稳定且发光强度到100万光子数，再稀释至10 mL，振荡混匀。

1.2.1 单一毒性实验

将样品稀释为5个设定的质量浓度，每个浓度3次平行，设置阴性质控（空白对照，2%NaCl溶液）和阳性质控（10 mg·L-1ZnSO4·7H2O溶液）。在96孔板中加入复苏并稀释后的菌液20 μL，用微孔板型多功能检测仪测试发光菌的初始发光强度，测试合格后，每孔加入180 μL的受试样品，20℃恒温反应15 min和30 min后测其发光强度，计算抑制率为10%和90%时对应的样品浓度，设为正式实验的浓度范围区间。根据预实验得到的质量浓度范围，设计10个几何级数质量浓度梯度，每个浓度3组平行，并设置空白对照和阳性质控，参照预实验方法，测试反应15 min和30 min后的发光强度，并计算EC50。

1.2.2 联合毒性实验

根据重金属铜、镉和农药杀螟丹、螺虫乙酯对费氏弧菌的单一毒性实验结果，以15 min EC50值为1个毒性单位，按等毒性单位比1∶1、1∶2和2∶1设计铜-杀螟丹、镉-杀螟丹、铜-螺虫乙酯、镉-螺虫乙酯的二元联合毒性试验。测定不同毒性单位比的混合物对费氏弧菌15、30、45、60、75、90 min的EC50。

1.3 混合毒性指数法计算联合毒性

式中：TUi为混合物中i组分的毒性单位；Ci为混合物中对生物产生半抑制影响的i组分浓度；EC50i为受试样本i的单一EC50值；TUi，max为混合物中所有组分毒性单位的最大值；MTI为混合毒性指数。

根据MTI值对联合毒性的类型进行判断：MTI＜0，拮抗作用；MTI=0，独立作用；0＜MTI＜1，部分相加作用；MTI=1，简单相加作用；MTI＞1，协同作用[16]。

1.4 数据处理

通过对比阴性质控样发光强度与受试样本发光强度，计算受试样本对费氏弧菌的抑制率，对相同暴露时间、不同浓度的抑制率进行曲线拟合，并计算各受试样本的EC50值。

2 结果与分析

2.1 单一毒性

实验中阳性质控10 mg·L-1ZnSO4·7H2O对费氏弧菌的抑制率在40%～60%，阴性质控2%NaCl对费氏弧菌的校正系数Cf值均在0.6～1.8之间，符合费氏弧菌冻干粉水质检测的国际标准ISO 11348-3和GB/T 15441—2012。受试样品中丙酮的浓度为0.5%，对费氏弧菌的抑制率低于2%。

重金属铜、镉和农药杀螟丹、螺虫乙酯对费氏弧菌的单一毒性结果如图1和图2所示。重金属铜、镉对费氏弧菌的毒性很强，暴露15 min后的EC50值分别为0.53 mg·L-1和0.74 mg·L-1，30 min后的EC50值分别为0.51 mg·L-1和0.67 mg·L-1，属于剧毒毒性。农药杀螟丹和螺虫乙酯相比铜、镉对费氏弧菌的毒性较低，属于中低毒性。杀螟丹对费氏弧菌15 min和30 min的EC50值分别为79.06 mg·L-1和55.68 mg·L-1，螺虫乙酯对费氏弧菌15 min和30 min的EC50值分别为116.68 mg·L-1和105.25 mg·L-1。

图1 重金属铜和镉对费氏弧菌作用15 min和30 min的EC50Figure 1 The 15 min and 30 min EC50of heavy metal copper and cadmium to Vibrio fischeri

2.2 联合毒性

重金属铜、镉和农药杀螟丹、螺虫乙酯的二元联合毒性结果列于表1和表2，采用MTI法评价暴露不同时间后混合物联合毒性的结果列于表3至表6。

铜-杀螟丹的混合体系中，当毒性单位比为1∶1时，15 min和30 min的联合毒性评价结果为部分相加作用，表明其联合毒性介于独立和相加作用之间，而在45 min表现为简单相加作用，60 min后表现为协同作用，说明毒性随时间增加而增强。配比为1∶2时，前45 min的评价结果相同，均为拮抗作用，表明两种物质联合毒性小于各物质单独毒性之和，说明毒性有所减弱。但是随着时间的增长，混合物对费氏弧菌的毒性增强，由拮抗变为部分相加作用。配比为2∶1时，随着时间的增长，联合毒性由拮抗变为简单相加。

图2 农药杀螟丹和螺虫乙酯对费氏弧菌作用15 min和30 min的EC50Figure 2 The 15 min and 30 min EC50of pesticides cartap and spirotetramat to Vibrio fischer

表1 铜-杀螟丹、镉-杀螟丹二元混合体系对费氏弧菌的EC50值Table 1 The EC50of binary mixtures of copper-cartap and cadmium-cartap

表2 铜-螺虫乙酯、镉-螺虫乙酯二元混合体系对费氏弧菌的EC50值Table 2 The EC50of binary mixtures of copper-spirotetramat and cadmium-spirotetramat

表3 铜-杀螟丹二元混合体系联合毒性评价Table 3 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of copper-cartap

表4 镉-杀螟丹二元混合体系联合毒性评价Table 4 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cadmium-cartap

镉-杀螟丹的混合体系中，随着暴露时间的增长，联合毒性由拮抗作用变为相加作用，且45 min时毒性明显增强，表现为部分相加，随后的暴露时间里，毒性小幅增长。

铜-螺虫乙酯的混合体系中，毒性单位比为1∶2时，混合物对费氏弧菌表现为拮抗作用，随着时间的增长，拮抗作用减弱。毒性单位比为1∶1和2∶1时，混合物对费氏弧菌的联合毒性为部分相加作用。

表5 铜-螺虫乙酯二元混合体系联合毒性评价Table 5 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of copper-spirotetramat

表6 镉-螺虫乙酯二元混合体系联合毒性评价Table 6 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cadmium-spirotetramat

镉-螺虫乙酯的混合体系中，毒性单位比为1∶1时，15 min和30 min表现为独立作用，随后毒性增强，表现为部分相加作用。毒性单位比为1∶2时，表现为拮抗作用。毒性单位比为2∶1时，随着时间的增长，联合毒性从拮抗作用变为部分相加作用。

3 讨论

从图1可得出受试样本对费氏弧菌的毒性顺序为铜＞镉，毒性顺序与其他生物如蚯蚓、人体等不同，可能是因为铜对水生细菌的毒性较大[17]。本研究中铜、镉对费士弧菌的毒性大小顺序与Tong等[18]和Mansour等[19]研究结果相同，但EC50值与其研究的数值有差异，可能是因为费氏弧菌的发光强度与其他因素（如温度、盐度、细菌质量浓度）有关。

图2中，杀螟丹的毒性大于螺虫乙酯，这与两种物质在其他生物体的毒性顺序相同。杀螟丹对南亚野鲮的 96 h LC50为 0.36 mg·L-1[20]，周胜利[8]用 98% 杀螟丹原药对斑马鱼胚胎进行暴露，发现96 h LC50为0.28 mg·L-1，而螺虫乙酯对非洲鲶鱼胚胎的急性毒性LC50为8.44 mg·L-1[6]，从两种物质对于鱼类胚胎的急性毒性LC50可以发现杀螟丹毒性大于螺虫乙酯。暴露15 min后，4种物质对费氏弧菌的单一毒性大小顺序为铜＞镉＞杀螟丹＞螺虫乙酯，暴露30 min，毒性大小顺序未发生改变且差异不显著，因此不再延长暴露时间。

杀螟丹、螺虫乙酯在与重金属铜、镉联合时，会抑制铜、镉的毒性，出现拮抗和部分相加作用。在表3和表4重金属与杀螟丹的毒性单位比为1∶2和2∶1的混合体系中，当杀螟丹占比较大时，联合毒性减弱，这可能是因为杀螟丹对细胞膜有损伤作用[21]，抑制了费氏弧菌对铜、镉的吸收从而降低了毒性。在表5和表6重金属和螺虫乙酯的毒性单位比为1∶2和2∶1的混合体系中，螺虫乙酯在混合体系中占比越大，则拮抗作用越强，这可能是因为螺虫乙酯抑制了费氏弧菌的生长，降低了其机体能量平衡和代谢相关基因的表达，降低了细胞膜的通透性[22]，从而降低了铜、镉渗入细胞膜内所产生的毒害作用。

在4种混合体系中，随铜、镉在混合体系中占比增加，联合毒性增强，且在暴露45 min后联合毒性有较为明显的增强，说明杀螟丹和螺虫乙酯可能只是减缓了铜、镉进入费氏弧菌的速率。在费氏弧菌为受试生物探究重金属与农药联合毒性的实验中，常以15 min和30 min时的EC50作为联合毒性的评价标准[23]。在杀螟丹、螺虫乙酯和重金属的联合毒性实验中发现，由于农药减缓了重金属进入费氏弧菌的时间，因此应延长对费氏弧菌的暴露时间至45 min以上。

从4种混合体系的联合毒性评价中可以明显看到，随着时间的增长毒性增强。污染物的毒性随时间动态变化，不同的污染物随时间可能有不同的毒性变化规律[24]。如Zhu等[25]采用浓度-时间-效应曲面研究了6种三嗪类除草剂对Q67的毒性，发现其毒性具有明显的时间依赖性，即毒性随着时间的延长而逐渐增加，但不同毒物的毒性增幅不同。此外，混合体系类型、混合配比对联合作用效应也会产生影响。如螺虫乙酯占比较高时，会抑制重金属进入细胞，部分表现为拮抗作用；当螺虫乙酯占比较低时，则表现为部分相加作用。因此在实际的生态风险评价中，要结合实际残留量来加以分析。

综上所述，杀螟丹与重金属的混合体系中，最终表现为相加作用或协同作用。虽然在混合体系中较高浓度的螺虫乙酯会抑制重金属离子的毒性，但实际水环境的农药残留和重金属混合体系中，螺虫乙酯残留常占比较低，因此实际情况仍体现了毒性增强。杀螟丹和螺虫乙酯在国内外广泛使用，如杀螟丹占到湄公河三角洲稻米和稻田养殖场杀虫剂使用量的19%[26]，且我国土壤环境和水环境中铜、镉含量普遍较高。农药残留和重金属都能通过降雨侵蚀和地表径流进入水生环境并共同作用于水生生物产生联合毒性。因此，虽然单一物质毒性相对较低，但是随着暴露时间的增长，杀螟丹、螺虫乙酯与铜、镉的联合毒性仍不容忽视，其中杀螟丹与重金属的联合毒性风险更大。

4 结论

在充分暴露的条件下，杀螟丹、螺虫乙酯与铜、镉联合毒性增强，整体表现为相加作用或协同作用，但当螺虫乙酯在混合体系中所占毒性单位比较大时，表现为拮抗作用。

由于农药能减缓金属离子进入费氏弧菌的速率，因此农药杀螟丹和螺虫乙酯与重金属铜、镉的联合暴露，体现为暴露初期重金属毒性受到抑制，而后联合毒性缓慢增强。采用发光细菌法评价联合毒性时，应将暴露时间从30 min延长至45 min以上。杀螟丹和螺虫乙酯虽是中低毒农药，但与重金属铜、镉混合时，对水生生物产生的联合毒性增强，并需进一步实验判定长期暴露的毒性。