解淀粉芽孢杆菌G9R-3脂肽类化合物抑制香蕉枯萎病菌机理及防效评价

周 维，田丹丹，杨 扬，韦 弟，李朝生，覃柳燕，刘挺燕，黄素梅*

(1.广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所，香蕉抗病种质创制与病虫害防控联合实验室，广西 南宁 530007；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心，海南 海口 571101)

【研究意义】由尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace 4，Foc4)引起的香蕉枯萎病被认为是目前全世界危害香蕉种植及产业发展的最严重病害。目前，大量研究实践表明抗病品种结合生物防控已成为防控香蕉枯萎病最切实可行的策略及方法，其中开发利用植物内生菌是目前生物防控研究的热点。已有研究表明内生菌与宿主能呈现互利共生关系，产生的活性物质能诱导或增强宿主植物对病虫害及逆境胁迫的抗性[1]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是目前生物防控应用较多的一类生防细菌，研究其生防机理发现其能产生多种抑菌物质，非核糖体途径合成的脂肽类物质就是其中重要一类，主要包括表面活性素Surfactin、伊枯草菌素Iturin、泛革素Fengycin等[2-3]；不同类型的脂肽类化合物具有不同的生物活性[4-5]。【前人研究进展】桑建伟等[2]研究发现脂肽类及聚酮类活性物质具有拮抗香蕉枯萎病FOC4活性。罗楚平等[6]和刘邮洲等[7]研究发现解淀粉芽孢杆菌产生的伊枯草菌素、泛革素具有较强的抗真菌活性，而表面活性素具有较强的抗细菌及溶血活性。Xiang等[8]研究发现泛革素及芽孢菌霉素对番茄枯萎病菌有较强的抑制活性。Deleu M等[9]研究认为芽孢杆菌产生的表面活性素虽无直接抗真菌活性但却能增强伊枯草菌素的抗真菌能力，其能在植物根部表面形成生物膜，阻止病原菌的入侵。【本研究切入点】前期研究发现，G9R-3是一株内生解淀粉芽孢杆菌，该菌株对尖孢镰刀菌Foc4有较强抑制作用，其能产生β-葡聚糖酶及挥发性抑菌物质(另文发表)。本研究拟对菌株G9R-3产生的脂肽类化合物类型及抑制Foc4活性进行分析，并开展盆栽防效研究。【拟解决的关键问题】探究G9R-3脂肽类化合物对 Foc4的抑菌作用机理并评价其防效，为香蕉枯萎病生防菌剂的研发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株G9R-3、香蕉枯萎病病原菌Foc4(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace 4)以及香蕉品种“桂蕉1号”香蕉组培盆栽苗均由广西农业科学院生物技术研究所提供；供试培养基为LB、PDA[10]以及Landy培养基[11]；供试仪器设备 Labconco 4.5 L型真空冷冻干燥机；热电LYNX6000型高速冷冻离心机；基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(Autoflex speedTMMALDI-TOF-MS, BrukerDalton，德国)。

1.2 试验方法

1.2.1 大孔树脂抽提法提取G9R-3脂肽类粗提物 参考桑建伟的大孔树脂抽提法[2]提取G9R-3发酵液中的脂肽类化合物：接种内生细菌G9R-3种子液，使用500 mL Landy培养基进行摇瓶发酵， 30 ℃，180 r/min摇瓶培养 2 d，取发酵液8000 r/min 离心收集上清液。向上清液中加入15 mL XAD-16大孔树脂，缓慢搅拌12 h后，滤纸片过滤。分别用超纯水及无水甲醇洗脱2次，收集全部洗脱液用冷冻真空干燥机进行冷冻干燥，称重后-80 ℃保存备用。

1.2.2 G9R-3 脂肽类化合物的种类分析 MALDI-TOF-MS具体方法参考Ongena等[12]，乙腈中加入0.1 %三氟醋酸配制提取溶剂，α-氰-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)配制辅助基质溶液，将粗提物母液与提取溶剂、辅助溶液依照3∶1∶1比例混匀稀释1000倍后检测。质量扫描范围为 900～2000 Da。

1.2.3 G9R-3脂肽类粗提物对Foc4 菌落生长的抑制作用 PDA培养基中加入脂肽类粗提物，制备终浓度分别为10、50、100、200、300 μg·mL-1的脂肽类化合物粗提物平板[2]，平板中央接种直径5 mm的Foc4菌饼，无毒 PDA 平板、无水甲醇分别作为空白对照及溶剂对照。每处理3重复，28 ℃培养7 d，十字交叉法测定菌落直径并依据公式计算菌落生长抑制率：抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-对照菌饼直径)×100。

1.2.4 G9R-3脂肽类粗提物对Foc4孢子萌发的抑制作用 摇瓶发酵培养，过滤菌丝后梯度稀释制备浓度为103CFU·mL-1的Foc4孢子悬浮液备用。带毒平板制备方法同 1.2.3。每个平板上涂布100 μl制备的Foc4孢子悬浮液，无毒PDA平板、无水甲醇作为空白对照及溶剂对照。每处理3重复，28 ℃培养3 d，记录孢子萌发数，并依据公式计算孢子萌发抑制率：抑制率(%)=(对照孢子萌发数-处理孢子萌发数)/对照孢子萌发数×100。

1.2.5 G9R-3 脂肽类粗提物对Foc4菌丝的影响 参照 1.2.3 的方法制备菌株G9R-3脂肽类粗提物带毒平板，平板中央接种Foc4菌饼培养7 d，插片法观察菌落边缘菌丝，无毒PDA平板、无水甲醇作为空白对照及溶剂对照，0.04 %台盼蓝染色10 min后，观察菌丝形态及染色情况。

1.2.6 G9R-3 脂肽类粗提物对香蕉枯萎病室内盆栽防效评价 依据1.2.1的方法，制备G9R-3发酵液及终浓度为1 mg·mL-1的脂肽类粗提物水溶液；按1.2.4方法，制备浓度为107CFU·mL-1的Foc4孢子悬浮液。选取株高一致，健康的“桂蕉1号”香蕉组培盆栽苗。采用灌根法分别接种上述菌株G9R-3发酵液及脂肽类粗提物水溶液，每株各浇灌20 mL，以清水为对照，每个处理30株。7 d后，每株伤根接种Foc4孢子悬浮液100 mL，60 d后调查植株发病情况。病情指数计算方法及病害分级标准参照农业行业标准(NY/T2248-2012)，平均发病率、病情指数及防效(%)计算公式如下。

A：表面活性素； B：泛革素；C：伊枯草菌素A: Surfactin；B: Fengycin；C: Iturins图1 MALDI-TOF-MS 分析菌株G9R-3脂肽类化合物类型Fig.1 Type of lipopeptide of strain G9R-3 analyzed by MALDI-TOF-MS

平均发病率(%)=各处理发病株数/调查总株数×100

病情指数 = {∑(各级病株数×该病级)}/(调查总株数×最高病级) ×100

防效(%)= (对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100

2 结果与分析

2.1 G9R-3脂肽类粗提物的提取及脂肽类化合物的种类分析

使用500 mLG9R-3 Landy培养基发酵液，大孔树脂抽提法提取脂肽类粗提物，冷冻干燥后称重，经计算得到粗提物样品浓度为442 mg/L。

结合MALDI-TOF-MS及LC-MS分析(图 1)，结果表明：菌株G9R-3脂肽类粗提物检测到含有表面活性素的离子峰，质核比值m/z=1030.63、1044.65、1058.66 Da(图1-A)；含有泛革素的离子峰，质核比值m/z=1470.11、1484.01、1498.16Da(图1-B)；含有伊枯草菌素的离子峰，质核比值m/z=1065.53、1079.63 Da(图 1-C)。综合以上质谱分析结果，菌株G9R-3脂肽类化合物种类包括泛革素类群、表面活性素类群和伊枯草菌素类群。

2.2 G9R-3的脂肽类粗提物对Foc4菌丝生长的抑制作用

G9R-3脂肽类粗提物对Foc4菌丝的生长具有较强的平板抑制作用(图 2、表1)。当终浓度为10 μg/mL时，粗提物对Foc4的菌丝生长产生抑制作用，随着浓度增加，抑制作用逐步增强，当粗提物终浓度为300 μg/mL时，对Foc4菌丝生长抑制率可达58.91 %；对照溶剂甲醇无显著抑制作用(P<0.05，下同)。

2.3 G9R-3的脂肽类粗提物对 Foc4 孢子萌发的抑制作用

试验结果表明(图3、表 2)，G9R-3脂肽类粗提物能显著抑制Foc4孢子在PDA平板上萌发。当终浓度为50 μg/mL时粗提物对Foc4的孢子萌发开始呈现明显抑制作用，抑制率为19.47 %；而当粗提物终浓度为300 μg/mL时，对Foc4孢子萌发抑制率可达69.8 %。对照溶剂甲醇无显著抑制作用。

CK1: 空白对照 (PDA)；CK2: 溶剂对照(PDA+ 无水甲醇)CK1:PDA； CK2:PDA+ Anhydrous methanol图2 不同浓度的G9R-3脂肽类化合物对Foc4菌丝生长的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of different concentrations of G9R-3 lipopeptides on the growth of Foc4 mycelia

2.4 G9R-3的脂肽类粗提物对Foc4菌丝形态的影响

采用台盼蓝染色法显微镜观察。结果表明，G9R-3脂肽类粗提物能严重抑制影响Foc4菌丝形态。当粗提物终浓度为300 μg·mL-1时，Foc4菌丝肿大，打结扭曲，呈现明显畸形。而空白对照和溶剂对照Foc4菌丝无显著变化(图4)。镜检观察各浓度粗提物带毒平板上生长的Foc4菌丝，经台盼蓝染色后，菌丝均被染成蓝色，而相应的空白对照和溶剂对照菌丝未见被染色(图 4)。表明G9R-3脂肽类粗提物能破坏Foc4菌丝细胞膜结构。

CK1: 空白对照 (PDA)；CK2: 溶剂对照(PDA+ 无水甲醇)CK1:PDA；CK2:PDA+ Anhydrous methanol图3 不同浓度的G9R-3脂肽类化合物对Foc4孢子萌发的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of different concentrations of G9R-3 lipopeptides on the germination of Foc4 spores

表2 不同浓度的G9R-3脂肽类化合物对Foc4孢子萌发抑制率

CK1: 空白对照 (PDA)；CK2: 溶剂对照(PDA+ 无水甲醇)CK1:PDA；CK2:PDA+ Anhydrous methanol图4 台盼蓝染色观察不同浓度的G9R-3脂肽类化合物抑制Foc4菌丝形态Fig.4 The inhibitory effects of different concentrations of G9R-3 lipopeptides on morphology of Foc4 mycelia observed by trypan blue staining

2.5 G9R-3脂肽类粗提物对香蕉枯萎病的室内盆栽防效

盆栽防效试验结果表明(表3)，菌株G9R-3脂肽类粗提物(浓度为1 mg·mL-1)对香蕉枯萎病防效达76.53 %，平均发病率和病情指数分别为16.67 % 和12.58，而对照平均发病率高达93.33 %，防控效果明显，差异达极显著(P<0.01)。而脂肽类粗提物与发酵液防效差异不显著(P>0.05)，对比分析可知，脂肽类化合物的抑菌活性是内生解淀粉芽孢杆菌G9R-3防控香蕉枯萎病的重要生防机制，化合物的纯化及可能产生的诱导植株抗性增加了防控效果。发酵液中活性物质相对浓度低，但菌株依靠自身拮抗病原活性能有效占据植株根际土壤生态位，降低了Foc4孢子浓度。

3 讨 论

大量研究表明，解淀粉芽孢杆菌能够促进植物生长及拮抗病原菌，因此通常被作为研究植物-微生物互作的模式菌株，其有8.5 %的基因组控制产生生物活性物质，诸如抗菌蛋白、脂肽类以及聚酮类物质[13-14]。脂肽类抗生素包括伊枯草菌素家簇 iturins、泛革素家簇 fengycins 和表面活性素家簇 surfactins[15-18]。除产生直接抗菌物质外，解淀粉芽孢杆菌还能诱导植株系统抗性(ISR)，通常是提前激活植株茉莉酸及乙烯防御反应信号通路，从而有效的抵御外界病原菌及寄生菌[19]。本研究通过MALDI-TOF-MS和LC-MS分析发现菌株G9R-3主要能产生Surfactin、Fengycin 和Iturin 3类脂肽类化合物。活性分析发现G9R-3脂肽类化合物能够抑制Foc4菌丝生长和孢子萌发，致畸菌丝并破坏细胞膜结构。这与国内外报道脂肽类物质Fengycin、Iturin抗真菌生物活性研究结果相似[2, 20-21]。Xiang 等报道 bacillomycin L对番茄枯萎病菌具有明显的抑制作用，可导致细胞膜穿孔和活性氧积累； Surfactin具有抗细菌活性，其能改变细菌的表面疏水性，从而破坏生物膜完整性[22-24]。向亚萍等通过室内平板拮抗试验发现Surfactin对番茄枯萎病菌生长的抑菌活性较弱，但其在防效评价试验中表现出良好的生防潜力，这与Surfactins 具有较强的表面活性及在植株根部形成能够抵御病原真菌侵入的生物膜有关[25-26]。Ongena等[27-28]还发现，surfactins 可以诱导大豆和番茄产生抗病性。本研究针对香蕉进行了枯萎病盆栽防效评价，结果表明菌株G9R-3脂肽类化合物能有效降低感病品种“桂蕉1号”枯萎病发病率及受病原侵染程度，分析可知菌株G9R-3抑菌活性是其防控香蕉枯萎病的重要机制，根据当前研究推测其产生的Fengycin、Iturin类物质抑制了 Foc4 的生长，降低了病原孢子浓度，同时推测其产生的surfactins类物质诱导了香蕉的抗病性并促进了菌株在植株根部的定殖,相关的诱导抗性机制有待进一步试验证实。G9R-3是一株分离来自香蕉抗病品种“桂蕉9号”健康植株根部的内生菌，其产物是否参与香蕉协同抗病还不得而知，依据MALDI-TOF-MS分析还不能确定具体的效应物质，利用HPLC-MS进一步分离鉴定效应化合物，并探明其与香蕉协同抗病机制是今后研究的重点。

表3 G9R-3脂肽类化合物室内盆栽防效评价结果

注：不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters represented significant difference at 0.05 levels.

4 结 论

香蕉内生解淀粉芽孢杆菌G9R-3能产生Surfactin、Fengycin 和Iturin 3类脂肽类化合物。其对香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace 4，Foc4)具有较好的抑制活性。其抑菌机理为破坏Foc4 细胞膜并引起菌丝肿大和畸形，并抑制其孢子萌发。盆栽防效评价表明菌株G9R-3脂肽类粗提物(浓度为1 mg·mL-1)对香蕉枯萎病防效达76.53 %。