围产期孕妇感染B族链球菌耐药性及相关耐药基因检测

【摘 要】目的：调查孕晚期妇女感染B族链球菌（GBS）耐药性以及相关大环内酯类耐药基因的表达情况。方法：K-B纸片扩散法检测GBS对红霉素和克林霉素的耐药性，再以D试验检测克林霉素诱导耐药表型。红霉素和克林霉素耐药基因用PCR方法检测。结果：未发现万古霉素、头孢哌酮/舒巴坦、头孢克肟耐药菌株，红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素的耐药率依次为74.19%、58.06%、77.2%、35.48%。青霉素有1例中介、1例耐药。ermB基因为主要的红霉素耐药基因，占51.61%。两种erm基因同时阳性占16.13%，有1株含erm B基因，但对红霉素敏感。所有的红霉素耐药菌株中未检出ermA、ermC基因。结论：青霉素仍可作为预防和治疗GBS感染的首选药物，红霉素和克林霉素作为替代药物表现出较高的耐药性和交叉耐药。ermB编码的核糖体修饰是导致大环内酯类耐药的主要机制。因此临床医生针对青霉素过敏，大环内酯类耐药的患者应及时根据药敏合理选择抗生素，避免重复选择大环内酯-林可霉素-链阳霉素B（MLSB）类抗菌药物，减少耐药菌株的产生。

【关键词】B族链球菌;耐药性;耐药基因

B群链球菌（group B streptococci，GBS），又称无乳链球菌，是新生儿肺炎、脑膜炎、菌血症的主要病原菌，围产期孕妇感染可导致早产、胎膜早破、晚期流产等不良妊娠结局[1，2]。目前治疗GBS感染主要使用β-内酰胺类和大环内酯类药物，随着大环内酯类抗生素的使用显著增加，我国GBS对大环内酯类抗菌药物尤其是红霉素的耐药问题也日趋严重，本研究旨在了解本地区GBS耐药性及相关大环内酯类耐药基因的表达，为临床治疗GBS提供指导，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源：采集2016年9月至2017年2月于我院就诊的35-37周妊娠晚期孕妇宫颈和直肠捻拭子，所有标本经细菌培养、CAMP试验、促酶试验鉴定后共收集GBS阳性菌株31株。

1.2 药敏试验

参照2013年美国临床及实验室标准协会（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）说明，采用K-B纸片扩散法测定GBS菌株对常用抗菌药物的敏感性;D试验法方法检测克林霉素诱导（MLSB）耐药表型。M-H琼脂及抗菌药物纸片购自南京茂捷微生物科技有限公司。金黄色葡萄球菌AT25923为质控菌株。

1.3 耐药基因检测

以PCR法检测耐药基因ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA、linB。PCR反应总体系为20μL，包括10×PCR Mix 10μL，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用ddH2O补足至20μl。引物由上海生工生物工程有限公司合成，Taq PCR MasterMix（含染料）、qPCR反应液和DNA标记物DL2000均购自Biomed公司产品。具体引物序列及PCR反应条件。

1.4 统计学分析

采用世界卫生组织细菌耐药性监测网提供WHONET5软件进行分析。

2 结果

2.1 药敏结果

红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素的耐药率依次为74.19%、58.06%、77.2%、35.48%。万古霉素、头孢哌酮/舒巴坦、头孢克肟100%敏感，青霉素有1例中介、1例耐药。

2.2 D实验结果

cMLS表型为主要耐药表型，占54.84%（17/31），检出M型6株，L型1株，未检出iMLS表型。

2.3 耐药基因结果

红霉素耐药基因以erm基因为主，其中ermB15株，ermTR基因6株。同时表达ermB和ermTR基因的有5株，同时表达ermB、ermTR和mef或者ermB、ermTR和linB基因有4株。所有标本均未检出ermA及ermC基因。克林霉素诱导耐药表型与大环内酯类耐药基因阳性的关系。

3 讨论

GBS又称无乳链球菌，是定植于患者胃肠道及泌尿生殖道常见的条件致病菌，围产期感染可导致多种不良母婴后果，因此筛查GBS带菌率，降低围产期GBS感染发生率和危害成为世界各国都重视的问题。我国在《孕前和孕期保健指南（第一版）》中也已明确将妊娠35～37周GBS篩查作为备查项目。

美国疾病控制中心（CDC）最新指南提出青霉素为治疗和预防GBS的首选药物，如对青霉素过敏，可选择头孢类抗生素，或选择红霉素或克林霉素替代[3]。目前红霉素和克林霉素耐药呈全球分布，而且有不断升高趋势。韩国在1995-2013年期间收集在三个不同区域的医院所获得的新生儿GBS分离株，所有菌株对青霉素敏感红霉素和克林霉素耐药率分别为51.8%和55.4%。相关文献调查发现深圳地区GBS对红霉素、克林霉素的耐药率分别为69.71%、64.86%，且2012-2015年耐药率逐年上升。本实验中红霉素、克林霉素耐药率分别为74.19%、58.06%，与国内多位学者的研究相近，明显高于南非、伊朗的研究数据。不同国家及地区的大环内酯类抗菌药物的耐药率存在差异可能与地区及人种差异有关。产前及产时预防性使用抗生素增加了大环内酯类抗菌药物耐药率，对青霉素过敏患者临床应根据药物试验结果及时调整用药方案，减少菌株耐药性的产生。本实验青霉素多数对GBS敏感，但有1例中介、1例耐药。日本和香港也有类似报道，说明青霉素仍可作为治疗GBS的首选药物，但其敏感度降低的趋势需要引起重视和关注。

GBS对大环内酯类耐药的机制主要有两方面，一是由mef基因编码的特异大环内酯类外排机制增强;二是erm基因通过编码的核糖体甲基化酶使23S r RNA甲基化，使大环内酯类抗菌药物靶位发生变化，导致大环内酯-林可霉素-链阳霉素B类抗菌药物（MLSB）与细菌核糖体靶位的结合力下降，产生结构性或诱导性耐药。本研究发现对红霉素耐药的GBS菌株主要耐药表型为cMLS表型，耐药基因为ermB（69.56%）。有16.12%的菌株同时检出了ermB和ermTR两种基因。同时表达ermB、ermTR和mef或者ermB、ermTR和linB三种基因的有4株。相关文献研究认为红霉耐药性主要与基因ermB、ermB-mefA（E）有关。最主要的表型为CMLS，占77.8%。有关文献从2008年到2013年收集了40例GBS分离株。在红霉素耐药菌株中73.0%仅携带ermB基因，5.4%携带mefA基因，21.6%表达ermB和mefA基因。此外38%的分离株检测到ermB和linB基因，mefA基因介导的外排泵也分布。多项研究提示GBS耐药是ermB介导核糖体靶位改变能起主导，多种耐药机制共同作用的过程。本研究有1株GBS不含上述红霉素耐药基因的任何一种基因，但仍对红霉素耐药，说明可能还有其他的机制尚未发现。

综上所述，青霉素类和头孢菌素类药物对GBS敏感性高，仍为首选推荐方案，大环内酯类抗菌药物作为备选药物耐药率逐年上升，同时检出的耐药基因种类增多。ermB编码的核糖体修饰是导致大环内酯类耐药的主要机制，临床医生在抗生素选择时应根据药敏结果合理选择，避免重复选择MLSB类抗菌药物，减少耐药菌株的产生。

参考文献

[1]应群华，严文卫，丁金龙.围产期生殖道菌群检测和B群链球菌筛查[J].中国微生态杂志，2006，18（6）：491-492.

[2]朱敏，范建霞，程利南.围产期B群链球菌研究进展[J].中华妇产科杂志，2005，40（2）：137-141.

[3]Verani JR， McGee L， Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease–revised guidelines from CDC， 2010. MMWR Recomm Rep 2010，59：1-36.

作者简介

邹霞，女，四川省泸州市人。研究生。检验师。研究方向为分子诊断。