基于TLR4/NF-κB信号通路探讨醒脑静改善反复缺血-再灌注脑损伤小鼠学习记忆能力的作用研究

廖卫宁　杨丽　张合　董文理

【摘要】 目的：探讨醒脑静通过TLR4/NF-κB信号通路改善反复缺血-再灌注（I/R）脑损伤小鼠学习记忆能力的作用。方法：将50只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组，醒脑静低、中、高剂量组，制备大鼠脑反复I/R损伤模型。造模成功2 h后，醒脑静低、中、高剂量组分别给予醒脑静注射液1、5、10 mL/kg进行腹腔注射，1次/d，连续给药7 d。假手术组和模型组腹腔给予等容量生理盐水。用Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力，对脑组织进行TTC染色，检测脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表达。结果：与假手术组相比，模型组小鼠逃避潜伏期的时间和脑梗死体积均显著升高，脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表达均显著升高，穿越平台次数显著降低（P<0.05）;与模型组相比，各醒脑静治疗组小鼠逃避潜伏期的时间和脑梗死体积均显著降低，脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表达均显著降低，穿越平臺次数显著增加（P<0.05），且随药物剂量增大而变化（P<0.05）。结论：醒脑静能减小脑梗死体积，改善反复脑I/R损伤小鼠学习记忆能力，其机制可能与抑制脑组织中TLR4/NF-κB信号通路，减轻炎症刺激有关。

【关键词】 醒脑静; TLR4/NF-κB信号通路; 反复缺血-再灌注脑损伤; 学习记忆能力

Effect of Xingnaojing on Learning and Memory in Mice with Repeated Ischemia-reperfusion Brain Injury Based on TLR4/NF-κB Signaling Pathway/LIAO Weining，YANG Li，ZHANG He，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（21）：030-034

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Xingnaojing on learning and memory in mice with repeated ischemia-reperfusion brain injury based on TLR4/NF-κB signaling pathway.Method：Fifty male C57BL/6 mice were randomly divided into sham-operated group and model group，and Xingnaojing low，medium and high dose groups.The brain repeated I/R injury model were established.Two hours after the successful establishment of the model，Xingnaojing low，medium and high dose groups were given intraperitoneal injection of 1，5 and 10 mL/kg respectively，once a day for 7 days.The sham-operated group and model group were given intraperitoneal saline of equal volume.Morris water maze test was used to detect the learning and memory ability of mice.TTC staining was used to detect the expression of TNF-α，IL-1β，IL-6，TLR4，NF-κB and IκBα in brain tissue.Result：Compared with the sham-operated group，the time of escape latency and the volume of cerebral infarction in the model group were significantly increased，and the expressions of TNF-α，IL-1β，IL-6，TLR4，NF-κB and IκBα in brain tissue were significantly increased，and the times of crossing the platform were significantly decreased（P<0.05）.Compared with the model group，the time of escape latency and the volume of cerebral infarction in the Xingnaojing treatment group were significantly decreased，and the expressions of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain tissue were significantly decreased，and the expression of TLR4，NF-κB and IκBα decreased significantly，and the number of times crossing the platform increased significantly（P<0.05），and changed with the increase of drug dosage（P<0.05）.Conclusion：Xingnaojing can reduce the volume of cerebral infarction and improve the learning and memory ability of mice with repeated brain I/R injury.Its mechanism may be related to inhibiting TLR4/NF-κB signaling pathway in brain tissue and alleviating inflammatory stimulation.

【Key words】 Xingnaojing; TLR4/NF-κB signaling pathway; Repeated cerebral ischemia-reperfusion injury; Learning and memory ability

First-authors address：Xianning Central Hospital，the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science and Technology，Xianning 437100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.21.008

缺血性脑卒中是全球成年人死亡和残疾的主要原因[1]。组织纤溶酶原激活剂（t-PA）静脉溶栓治疗缺血性脑卒中目前已获批准，但会引起脑缺血/再灌注（I/R）损伤等继发性损伤[2]。所以，预防脑I/R损伤对缺血性脑卒中的治疗具有重要意义。免疫介导在脑I/R损伤中的作用日益被关注[3]。Toll样受体（TLRs）在炎症反应诱导中的重要作用已被证实，Toll样受体4（TLR4）在脑I/R后被发现具有高度的诱导作用，可诱导激活多个激酶和核转录因子κB（NF-κB）[4]。有研究显示，TLR4/NF-κB信号通路参与脑I/R损伤的损伤性炎症过程，抑制TLR4/NF-kB信号通路可下调炎症反应，减轻脑损伤[5]。因此，TLR4/NF-kB信号通路可能是脑I/R损伤的治疗靶点。目前，许多研究集中在探索抗炎和神经保护因子，可能减轻脑I/R损伤。醒脑静由麝香、冰片等提取精制而成的传统中药，对各种病因引起的意识障碍以及高热等具有显著疗效，可通过降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）等促炎细胞因子的产生，抑制炎症细胞浸潤，但醒脑静对意识障碍的治疗作用的机制尚不清楚[6-7]。因此，考虑到醒脑静在炎性疾病和意识障碍中的作用，本研究假设醒脑静通过下调TLR4/NF-κB信号通路来保护脑I/R损伤，探索醒脑静在脑I/R损伤中的潜在作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雄性6周龄C57BL/6小鼠50只，体重18～24 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2012-0002。在SPF环境中自由进食和饮水，控制饲养环境昼夜循环（12 h/12 h），适应性喂养一周后进行实验。动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求。

1.2 主要试剂与仪器 醒脑静注射液（生产厂家：无锡济民可信山禾药业有限公司，批准文号：Z32020563）;三苯基四氮唑（TTC）（生产厂家：美国Biosharp公司，注册证号：EZ1609A129）;3%戊巴比妥（生产厂家：上海上药新亚药业有限公司，批准文号：H31020532）;肌酸磷化脢-同工脢MB（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）[生产厂家：中生北控生物科技有限公司，批准文号：京药监械（准）字2010第2400837号和第2400838号];TNF-α、IL-1β和IL-6酶联免疫吸附试剂盒（生产厂家：京美生物科技有限公司）;BCA蛋白测定试剂盒和Western Blot试剂盒（生产厂家：上海碧云天生物技术有限公司）;蛋白抽提试剂盒（生产厂家：武汉博士德生物工程有限公司）;TLR4、NF-κB和IκBα（生产厂家：美国Santa Cruz公司）;鼠抗β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG二抗（生产厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司）;Morris水迷宫装置及DigBehv动物行为分析系统（生产厂家：上海吉量软件科技有限公司，中国）;HBS-1096B酶标仪（生产厂家：南京德铁实验设备有限公司）;凝胶成像仪（生产厂家：美国UVP公司）;BIO-RAD垂直电泳仪（生产厂家：美国BIO-RAD公司）。

1.3 分组与造模 根据随机数字表法将小鼠均分为假手术组，模型组，醒脑静低、中、高剂量组。每组用5只大鼠进行水迷宫实验和TTC染色、5只进行脑蛋白测定。制备大鼠脑反复I/R损伤模型：大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，用无损动脉夹夹闭左侧颈总动脉20 min，松开动脉夹10 min后再关闭，反复3次，最后去除动脉夹，恢复血液供应，用生理盐水清洗切口后逐层缝合，分笼饲养。假手术组只分离血管，不进行阻塞血流。造模成功2 h后，醒脑静低、中、高剂量组分别给予醒脑静注射液1、5、10 mL/kg进行腹腔注射，1次/d，连续给药7 d。假手术组和模型组腹腔给予等容量生理盐水。

1.4 Morris水迷宫实验 术前第3天至手术前小鼠在Morris水迷宫内自由游泳以适应环境，术后第3天开始对大鼠进行水迷宫训练，连续进行4 d。在停药后进行水迷宫实验。

1.5 TTC染色 做完Morris水迷宫实验后处死小鼠，取完整脑组织，行冠状位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸盐缓冲液终止染色。用Image Pro Plus 6.0软件计算梗死体积。

1.6 Elisa法检测脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平 取适量损伤侧脑组织，制成匀浆，吸取上清进行实验。根据ELISA试剂盒说明书进行IL-1β和TNF-α含量测定，在450 nm处测各孔吸光度（A）值。

1.7 Western Blot法检测脑组织中TLR4、NF-κB和IκBα的表达 取适量损伤侧脑组织，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，用预冷的PIPA裂解液充分匀浆，冰浴2 h;离心取上清，-80 ℃保存。进行电泳、切胶;孵育一抗、孵育二抗，用凝胶成像系统采集图像并进行分析。

1.8 統计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，采用单因素方差分析进行检验，组间比较用SNK-q检验。以P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 醒脑静对反复脑I/R损伤小鼠学习记忆能力的影响 与假手术组相比，模型组小鼠逃避潜伏期时间显著升高，穿越平台次数显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，各醒脑静治疗组小鼠逃避潜伏期的时间均显著降低，穿越平台次数显著升高，且随药物剂量增大而变化，差异均有统计学意义（P<0.05）。与假手术组相比，模型组小鼠脑梗死体积显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，各醒脑静治疗组小鼠脑梗死体积显著降低，且随药物剂量增大而降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1和图1。

2.2 醒脑静对反复脑I/R损伤小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响 与假手术组相比，模型组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，各剂量醒脑静治疗组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著降低，且随药物剂量增大而降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 醒脑静对反复脑I/R损伤小鼠脑组织中TLR4、NF-κB和IκBα表达的影响 与假手术组相比，模型组小鼠脑组织中TLR4、NF-κB和IκBα表达均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，各剂量醒脑静治疗组小鼠脑组织中TLR4、NF-κB和IκBα表达均显著降低，且随药物剂量增大而降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3和图2。

3 讨论

脑血管病是临床常见病，脑缺血性卒中是最常见的。脑缺血性卒中的后果之一是脑缺血导致脑梗死，进而导致认知功能障碍和血管性痴呆，给患者及其家属带来巨大的经济负担和精神压力[8]。选择C57BL/6小鼠作为实验动物，因为在小鼠品系中，C57BL/6小鼠最易发生脑缺血。它们的后交通动脉也发育不良，因此无法弥补额叶脑缺血，有助于建立反复脑I/R损伤模型[9]。Morris水迷宫主要检测空间记忆能力，可以排除动物情绪改变的干扰，尤其对与海马密切相关的认知功能高度敏感[10]。本研究结果表明，醒脑静对小鼠大脑的学习记忆功能有神经保护作用。同时，经醒脑静处理的小鼠脑梗死灶大小均有明显改善。因此，醒脑静可能是一种潜在的治疗认知缺陷的有效药物。

近年来，越来越多的证据表明，免疫介导机制在脑I/R继发性脑损伤中发挥关键作用。免疫介导的机制成为一个新的前沿，脑I/R引起的脑损伤部分原因是脑缺血发作后短时间内炎症继发损伤[11]。因此，在设计改善脑I/R损伤结局的治疗策略时需要更多的考虑，抑制炎症反应已成为脑I/R损伤的治疗靶点。

醒脑静在炎性疾病和神经病理学中具有保护作用[12]。然而，醒脑静对脑I/R损伤的神经保护作用尚不清楚，醒脑静对炎症信号通路的拮抗能力尚待确定。在脑I/R损伤后的炎症反应中，胶质细胞被激活，外周免疫细胞浸润大脑，分泌大量炎症细胞因子，诱导神经细胞凋亡。TNF-α、IL-1β和IL-6是潜在的细胞炎性因子，在脑I/R进展过程中，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平显著增加[13]。本研究结果表明，醒脑静显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平。因此，醒脑静抑制脑I/R后炎症反应。在接下来的研究中，继续探索了其神经保护和抗炎作用的潜在机制。

TLRs的激活已被证实在炎症反应的诱导中发挥重要作用，TLRs是一类跨膜模式识别受体，可被缺血损伤或应激细胞释放的内源性损伤相关分子模式（DAMPs）激活[14]。TLR4是第一个被发现的哺乳动物TLRs。DAMPs可以激活邻近小胶质细胞中的TLR4/NF-κB信号通路，诱导促炎细胞因子的释放，导致神经细胞的变性和凋亡[15]。在脑I/R损伤中，TLR4表达增加，激活NF-κB，导致IκBα磷酸化[16]。近期研究也证明，TLR4缺乏症小鼠脑I/R后TLR4低诱导，脑I/R损伤减轻[17]。炎症的发生受到一系列基因的表达和调控，NF-κB是其中关键成员。在脑I/R损伤恶化后，NF-κB表达增加，导致生成大量的炎症细胞因子并释放[18]。本研究结果显示，醒脑静能抑制TLR4/NF-κB信号通路。

综上所述，醒脑静通过抑制脑组织中TLR4/NF-κB信号通路，能改善反复脑I/R损伤小鼠学习记忆能力。同时，醒脑静调节炎症反应参与了TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达，为进一步了解醒脑静治疗脑I/R损伤的机制提供了新的思路。

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（收稿日期：2019-05-08） （本文編辑：程旭然）