肺炎支原体实时荧光定量DNA检测的临床研究

肖宗浩

【摘要】 目的：分析肺炎支原體实时荧光定量DNA检测的临床研究。方法：将2017年8月-2018年2月本院收治的98例呼吸道感染患儿作为此次研究检测对象，均行MP-DNA和肺炎支原体血清学抗体检测，观察两种检测方法的最终阳性检出率与不同时间点的检测情况，并观察两组患儿症状缓解时间、重症病例发生情况、肺外并发症、后遗症、住院天数等情况。结果：本组98例呼吸道感染患儿中确诊为MP感染者共36例，占比36.73%，其中MP-DNA阳性检出35例，MP-IgM阳性检出33例，两种方法最终MP感染检出率对比差异无统计学意义（P>0.05）;在所有MP感染患儿中，入院当日确诊为MP感染者共29例，入院后1周确诊者33例，入院后2周确诊者36例，MP-DNA检测在入院当日阳性检出率明显高于MP-IgM，差异有统计学意义（P<0.05），经不同方法检测后并接受一段时间治疗显示MP-DNA检测者症状缓解时间及住院天数均短于MP-IgM检测，且MP-DNA检测并接受治疗者重症病例、肺外并发症及后遗症发生率均少于MP-IgM者，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：实时荧光定量DNA检测对MP感染的早期诊断具有积极的意义，在临床上可以早期干预，对预防重症病例的发生及减少因MP感染引起的并发症及后遗症。

【关键词】 呼吸道感染; 肺炎支原体; 感染; 血清学抗体; 实时荧光定量DNA

Clinical Study of MP-DNA Detection with Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction/XIAO Zonghao.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：0-053

【Abstract】 Objective：To study the mycoplasma pneumoniae- deoxyribose nucleic acid（MP-DNA）detection with real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time quantitative PCR）.Method：A total of 98 respiratory tract infection children treated in our hospital from August 2017 to February 2018 were selected.Children were tested by MP-DNA and MP-IgM.The positive detection rate and detection conditions at each time period as well as symptom relief time，incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela and hospitalization days were estimated.Result：36 cases（36.73%）were proved as MP infection，the positive detection cases based on MP-DNA and MP-IgM were 35 cases and 33 cases，the MP infection rate based on two methods was not statistically different（P>0.05）.Among MP infection children，29 MP infection cases were proved upon admission to hospital，33 cases after 1 week of admission and 36 cases after 2 weeks of admission.Upon admission to hospital，the positive detection rate based on MP-DNA was statistically higher than that of

MP-IgM（P<0.05）.After treatment，the symptom relief time and hospitalization days based on MP-DNA were shorter than those of MP-IgM，the incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela based on MP-DNA were statistically lower than those of MP-IgM（P<0.05）.Conclusion：The real-time quantitative PCR is of great importance to the early diagnosis of MP infection，can reduce the incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela.

【Key words】 Respiratory tract infection; Mycoplasma pneumoniae; Infection; Serological antibody;Real-time quantitative PCR

First-authors address：Meizhou Maternal and Child Health Family Planning Service Center，Meizhou 514000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.013

肺炎支原体（MP）可引起人类上呼吸道和下呼吸道感染，亦是引起儿童呼吸系统感染的重要病原之一，MP属于柔膜体纲原核生物，缺乏细胞壁，对细菌性肺炎治疗中常用的靶点为细胞壁的抗生素（如青霉素、头孢类等）无效[1]。除了引起儿童、成人呼吸系统感染外，许多研究表明肺炎支原体还与许多其他肺外病变有关[2]。MP感染后治疗不及时、不彻底容易引起反复呼吸道感染和严重的并发症，因此早期诊断尤为重要，可避免临床上用药不当而延误病情或产生耐药菌[3]。以往多采用MP培养和分离，但由于MP生长缓慢，一般培养法不能满足临床快速诊断的需求，荧光定量DNA检测是目前国内外最常用的MP感染诊断方法，其具有高度的敏感性和特异性，在MP感染的早期诊断中起到非常重要的作用[4-5]。

此次研究对2017年8月-2018年2月本院儿科住院的98例呼吸道感染患儿进行MP实时荧光定量DNA检测和MP血清学抗体检测，观察不同检测方法的检出情况及患儿预后治疗情况。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 此次研究案例资料均来源于2017年8月-2018年2月本院儿科收治的呼吸道感染的患儿。纳入标准：出现明显的呼吸道感染症状;入选前未接受抗生素治疗者;均为起病1周以内就医的患儿;对所有受试者采取的医疗措施均取得受试者家属知情同意。排除标准：合并其他肺部疾病或心肝肾等脏器功能不全者;精神或认知功能障碍，无法配合检测治疗者。最终98例患儿纳入研究，其中男56例和女42例，年龄3个月～12岁，平均（5.51±2.50）岁，年龄分布：3个月～4岁52例，4～8岁26例，8岁以上20例。本研究经院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 所有患者分别在入院当日、入院后1周及入院后2周抽取血标本常规送检，用微型颗粒凝集法（日本富士Serodla-macoⅡ颗粒凝集试剂盒）检测血清MP-IgM抗体，严格按照试剂盒说明书进行操作。同时分别在这三个不同时间点定量取0.20 mL血清，按照实时荧光定量PCR试剂盒（由TaKaRa公司提供）提供的以下反应体系进行PCR：总体积25 μL（含有12.5 μL的1×SYBR Premix DimerEraser，0.2 μmol的特异引物，2 μL cDNA模板）。PCR反应条件如下：95 ℃ 30 s一个循环，95 ℃ 5 s和60 ℃ 31 s 40个循环。根据检测已知浓度的倍比稀释的纯化肺炎支原DNA的PCR产物做出的标准曲线对肺炎支原体DNA的PCR产物进行定量。

1.2.2 治疗方法 当MP-DNA检测，将拷贝数≥1×103 copy/mL的阳性患儿考虑为MP感染;

MP-IgM检测，将MP-IgM≥1︰160的阳性患儿考虑为MP感染。明确诊断后给予抗支原体治疗，首先进行呼吸道隔离，休息，供给足量水分及营养。积极化痰止咳，及时清除鼻内分泌物，保持呼吸道通畅，必要时可雾化吸入。选用具有缓慢而持久作用的解热镇痛药，如乙酰氨基酚。关于该病的抗菌治疗：（1）临床首选阿奇霉素，用量为10 mg/（kg·d），5 d为一疗程。根据情况可以应用2～4个疗程，甚至更长。阿奇霉素每日仅需1次用药，使用天数较少，已成为治疗首选[2]。但对于6个月以下的婴儿，阿奇霉素的使用尤其是静脉制剂的使用要慎重，最好使用口服阿奇霉素制剂[3]。（2）支原体肺炎至少住院正规治疗2周后改为口服药物治疗，否则疗程过短容易反复。目前治疗肺炎支原体肺炎的主导药物为新大环内酯类（阿奇霉素、克拉霉素）、四环素类（多西环素、米诺环素）和喹诺酮类（环丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星）药物。抗感染治疗的疗程通常需要持续10～14 d，部分难治性病例的疗程可延长至3周左右，但不宜将肺部阴影完全吸收作为停用抗菌药物的指征。（3）在上述三类抗菌药物中，氟喹诺酮类药物一般情况下应避免用于18岁以下的未成年人;四环素类药物可引起牙齿黄染及牙釉质发育不良，8岁以下的儿童亦不宜使用。

1.3 观察指标 观察两种检测方法最终MP阳性检出率与不同时间点MP感染的检测情况，即入院当日、入院后1周、入院后2周进行观察，并观察两组患儿症状缓解时间、住院天数、重症病例发生情况、肺外并发症、后遗症情况。

1.4 诊断标准 以双份血清抗体低度呈4倍以上增长作为确诊MP感染的金标准，并联合临床症状、胸片等，参照诸福棠《实用儿科学》第7版中难治性肺炎支原体肺炎的诊断标准进行确诊[4]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法最终检出MP感染情况 本组98例呼吸道感染患儿中確诊为MP感染者共36例，占比36.73%，其中MP-DNA阳性检出35例，MP-IgM阳性检出33例，两种方法最终MP感染检出率对比差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 不同时间点MP感染检测情况比较 本组98例患儿，入院当日确诊为MP感染者共29例，入院后1周确诊者32例，入院后2周确诊者35例，MP-DNA检测在入院当日阳性检出率明显高于MP-IgM，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 两种检测方法治疗后症状缓解时间、住院天数比较 经不同方法检测后，两组患儿接受一段时间治疗显示，MP-DNA检测者症状缓解时间及住院天数均短于MP-IgM检测，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.4 两种检测方法治疗者重症病例、肺外并发症以及后遗症发生情况比较 MP-DNA检测并接受治疗者重症病例、肺外并发症以及后遗症的发生率均少于MP-IgM者，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

MP是儿童社区获得性肺炎（CAP）的重要病原之一，肺炎支原体肺炎（MPP）占住院儿童CAP的10%～40%，是儿科医师广泛关注的临床问题[6]。MP感染的临床表现多种多样，感染既可以发生在上、下呼吸道及肺脏，亦可累及肺外系统，MP感染的临床症状不具有特征性，其疾病的严重程度可变度大，可能会危及生命或导致严重的后遗症[7-8]。近年来，儿童MPP呈现不少新的特点，临床上不断有肺炎支原体的报道，使用了“重症肺炎支原体肺炎（SMPP）”“难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）”“大环内酯类耐药肺炎支原体肺炎（MRMPP）”等名称，显然MP感染给临床带来了新的问题和难点，更带来诊治上的挑战[9-10]。因此，对MP感染的早期诊断显得尤为重要，早期干预对预防重症及减少并发症的发生起到积极的作用[11]。

目前临床上MP的病原学检测：MP的培养和分离、MP核酸扩增技术、MP血清学检测。其中经典的MP培养和分离是对咽拭子、气道吸出物、胸腔穿刺液和肺泡灌洗液进行MP的分离培养，是诊断最可靠的依据[12]。但MP培养条件苛刻，生长缓慢，因而缺乏早期诊断价值。MP血清学检测是目前临床诊断MP感染的主要手段[13]。血清学检测主要检测MP-IgM、MP-IgG。单次MP-IgM抗体滴度≥1︰160对MP近期感染或急性感染有诊断价值，恢复期和急性期MP-IgM或IgG抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，亦可诊断为MP感染[14]。但血清学检测结果受病程的影响，即使早期产生的IgM也需要在感染1周后才能被检测到[15]。婴幼儿由于免疫功能尚未发育完善、产生抗体的能力较低，可能出现假阴性或低滴度的抗体[16]。2009-2012年北京儿童医院对呼吸道感染儿童使用MP实时荧光定量检测病原进行流行病学的统计[17]，近年分子检测技术广泛应用于MP诊断领域，包括普通PCR、巢式PCR、RT-PCR等，其可快速检测到体内微量MP-DNA，方法的敏感度、特异度好，且不受患者免疫功能的影响[18]。杨文青等[19]对742例儿科住院患儿收集标本进行MP-DNA的定量检测得出，4岁及以上儿童易感染肺炎支原体，且随着年龄增长感染率逐渐增高;支气管灌洗液标本的MP-DNA阳性率较高;FQ-PCR法检测MP-DNA用于肺炎支原体感染的诊断有一定价值;林超群等[20]亦在研究中说明实时荧光定量PCR法对肺炎支原体感染的诊断与治疗后监测比肺炎支原体抗体血清学检测更优。为进一步尽早精准诊断，及时给予精准治疗，对本院98例呼吸道感染患儿分别行MP-DNA和肺炎支原体血清学抗体检测，结果显示：MP-DNA与MP-IgM两种方法在MP感染阳性检出率对比，差异无统计学意义（P>0.05），但MP-DNA检测在患儿入院当日MP感染阳性检出率明显高于MP-IgM，差异有统计学意义（P<0.05），经不同方法检测后并接受一段时间治疗显示Mp-DNA检测者症状缓解时间及住院天数均短于MP-IgM检测，且Mp-DNA检测并接受治疗者重症病例、肺外并发症以及后遗症的发生率均少于MP-IgM者（P<0.05）。可见实时荧光定量能检测出病原体的DNA和RNA，能反映MP在人体内的生存情况，其不受年龄、产生抗体的能力、病程长短及用药等因素的影响，在MP感染早期的检出率最高。

然而关于肺炎支原体如何进入血液循环的机制目前尚未完全明确，以下几点是本研究尚未解决而需作进一步研究的：（1）相同的肺炎支原体感染患者中同时检测痰液、咽拭子与血清中的肺炎支原体DNA定量，比较其检测率的差异;（2）比较血清与全血中肺炎支原体DNA定量的差异;（3）扩大样本含量，进行肺炎支原体抗体与肺炎支原体DNA定量在各个病程阶段的对比研究。综上所述，MP感染可损伤全身任何系统，也说明其疾病的严重程度可变度大，可能危及生命或导致严重的后遗症。因此早期诊断、早期治疗显得尤为重要，实时荧光定量MP-DNA在MP感染早期的检出率最高，检测时间短，敏感度及特异度高。早期精准诊断，早期治疗，避免了滥用或迟用抗生素给患儿带来的危害，对减少MPP重症病例、并发症及后遗症的发生及缩短住院时间等有一定的现实意义，有利于在全市、全省甚至全国基层医院推广，具有很好的应用前景。

参考文献

[1]张慧芬，白海涛，李基明，等.肺炎支原体肺炎患儿肺炎支原体耐药性与DNA载量和基因型的关系研究[J].中国当代儿科杂志，2017，19（11）：1180-1184.

[2]林苗苗，施李芬，余坚，等.肺炎支原体RNA和DNA检测技术对儿童肺炎支原体肺炎诊断的价值[J].中国妇幼保健，2018，33（5）：1054-1056.

[3]胡淼，马燕芬，李向平，等.RT-PCR检测在疑似肺炎支原体感染患者中的应用研究[J].国际检验医学杂志，2017，38（11）：1480-1481，1484.

[4]胡亞美，江载芳.诸福棠实用儿科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2002：1185-1191.

[5]袁红霞，李青曌，刘巧突，等.肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液MP-DNA载量及免疫炎症指标变化的临床意义[J].中华医院感染学杂志，2018，28（1）：135-138.

[6]宋建领，高华峰，信爱国，等.猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].畜牧与兽医，2013，45（5）：71-74.

[7]李丹，李静宜，董艳青，等.利用环介导等温扩增技术检测儿童咽拭子标本中肺炎支原体[J].山东大学学报（医学版），2014，52（10）：55-60.

[8]李锐成，阎琳，邹菊贤，等.961例呼吸道感染患儿

MP-DNA检测结果分析[J].国际检验医学杂志，2013，34（20）：2675-2677.

[9]李菁，包军，鲍一笑，等.肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液病菌量及其与Th1/Th2细胞免疫应答的关系[J].临床儿科杂志，2015，33（8）：681-685.

[10]谢辉，李基明，张慧芬，等.肺炎支原体抗体和载量指数在儿童肺炎支原体肺炎诊断中的应用[J].中国当代儿科杂志，2016，18（10）：984-987.

[11]陈雄毅，岑丽莲，申学基，等.肺炎支原体、衣原体感染与新生儿肺炎的关系研究[J].国际检验医学杂志，2017，38（13）：1847-1848.

[12]高正琴，岳秉飞，关伟鸿，等.CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用[J].中国比较医学杂志，2013，23（8）：9-13，19.

[13]薄艳丽，戴四海.肺炎支原体肺炎患儿MPLI、肺炎支原体抗体、CRP、IL-8变化及临床意义[J].当代医学，2017，23（24）：63-65.

[14]成云改，李淑娴，李雪静，等.肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液病菌量与临床特征相关性研究[J].中华儿科杂志，2013，51（10）：736-740.

[15]章伟，李姗姗，谷强，等.支气管肺泡灌洗液荧光定量PCR检測大叶性肺炎患儿肺炎支原体的效果[J].中国医药导报，2014，11（33）：91-93，98.

[16]王晶，甘轶文，毛李征，等.实时荧光定量PCR在儿童肺炎支原体感染中的诊断价值[J].实用临床医药杂志，2015，19（15）：91-93.

[17]杨晓菲，赵翠芬，孔清玉，等.实时荧光定量PCR检测儿童肺炎支原体16S rRNA的临床意义[J].热带医学杂志，2017，17（8）：1067-1070.

[18] Waites K B，Xiao L，Paralanov V，et al.Molecular methods for the detection of Mycoplasma and ureaplasma infections in humans：a paper from the 2011 William Beaumont Hospital Symposium on molecular pathology[J].J Mol Diagn，2012，14（5）：437-450.

[19]杨文青，吕晓丽，李锐成，等.实时荧光定量PCR检测肺炎支原体DNA在小儿肺炎诊断中的应用价值[J].国际检验医学杂志，2014，35（4）：416-418.

[20]林超群，黎运西，黎冠峰，等.血清肺炎支原体 DNA 定量对肺炎支原体感染的诊断价值[J].广东医学，2015，36（12）：1880-1882.