新建体外受精实验室显微注射系统操作改进探究

饶金鹏，邱 枫，蔡益婷，金 帆，金 敏

新建体外受精实验室显微注射系统操作改进探究

饶金鹏1，邱 枫1，蔡益婷1，金 帆2，金 敏1

（浙江大学 医学院附属第二医院体外受精实验室，浙江 杭州 310052；浙江大学医学院附属妇产科医院，生殖遗传教育部重点实验室，浙江 杭州 310006）

针对新建成的体外受精实验室中显微注射操作系统不稳定，导致卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）卵膜刺破效果不佳或过程中损伤卵子纺锤体等问题，对连接了显微注射针的Eppendorf CellTram vario油压式手动显微注射仪的整体通道进行调整，提高卵子破膜及单精子注射的稳定性。通过增加显微注射仪管道内矿物油的更换频次并调节活塞相对位置，保证液压系统的通畅，通过控制显微注射针内介质从针尖至针尾依次为聚乙烯吡咯烷酮、培养油、空气、矿物油，保证针尖不污染、不堵塞，同时控制回吸、破膜、注射和退针的节奏，使ICSI操作得以顺利实施。经过分析及改进，ICSI后卵子退化率显著下降（<0.05），而受精率、优质胚胎形成率以及临床妊娠率均有所提高。

ICSI；显微注射针；显微注射仪；液压系统；临床妊娠率

自1978年借助体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）技术诞生第一例“试管婴儿”路易斯·布朗以来[1]，全世界的试管婴儿已达数百万。作为人口大国的中国，目前不孕症的发病率约为15%[2]，且呈现逐年增加趋势。面对激增的不孕不育人口，我国的辅助生殖机构也由2005年的37家发展到2013年的358家[3]。辅助生殖机构的快速增长也对辅助生殖技术（artificial reproductive technology，ART）的开展提出更高的要求。本文以卵胞浆内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）为例，介绍浙江大学医学院附属第二医院体外受精实验室对显微注射系统操作的改进措施和经验总结，为其他新建IVF实验室顺利开展ICSI技术提供参考。

1 ICSI显微注射系统的组成及在新建IVF实验室使用时易出现的问题

1.1 ICSI显微注射系统的组成

ICSI显微注射系统大致由倒置显微镜、显微注射仪、显微注射针3部分组成（图1）。其中，倒置显微镜备有×10的目镜以及×10、×20、×40的物镜头，调整放大倍数至200倍能使精子及卵子处于较佳的操作视野下[4]。显微注射仪为一套液压或气压传动的连接注射器的负压控制装置，目前常用的有日本的Narashige、PrimeTech,德国的Eppendorf以及英国的Research Instruments（RI），其中德国的Eppendorf CellTram vario（图1(b)）由于具备位置记忆功能,具有（1∶1和1∶10）两种调节精度的旋钮，且其油压控制系统较RI等气压系统免去了制备平衡用培养皿等步骤，而被更多IVF实验室采用[5]。显微注射针为头部具有一定倾斜角度的细针，其内径一般为4.8~ 5.6mm，外径为6.8~7.8mm，内径过小则在吸入精子时容易损伤其头部，内径太大则可能增加对卵母细胞的损伤[6]，ICSI操作时易选用30°角、内径为5mm的注射针[4-5]。

图1 ICSI显微注射系统组成

1.2 新建IVF实验室在使用显微注射系统时易出现的问题

（1）显微注射仪液压管路易堵塞。新建成的IVF实验室，由于运行初期患者数量所限，开展的ICSI例数远小于大型成熟生殖中心。此外，ICSI的实施还需满足特定的指征（严重或极少弱精子症、前次IVF不受精或受精率<30%等），这就会出现新建IVF实验室某个时间段（1~2个月）因无符合指征的患者而使得显微注射仪处于闲置状态。虽然Eppendorf CellTram vario显微注射仪在使用说明书上明确印有液压管路内的填充质——“油（免维护）”字样，而IVF实验室指导用书《体外受精-胚胎移植实验室技术》[5]以及最新版本的《卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术规范》[4]中也均无给出需定期更换油性介质的建议，大型生殖中心开展ICSI操作是常态化的，即管路内的油长期处于“流动”状态，一旦油量下降能够得到及时的添加更新；而新中心就会出现液压管路内的石蜡油因长期滞留而堵塞管路引起压力输出不稳定。若油压过大会导致显微操作时精子吸入和吐出过快、不易控制，而用显微注射针进行回吸、破膜时，由于吸力过强而破坏卵母细胞的纺锤体和胞质的微管结构，在注射精子时也会因输注速度过快而带入过多精子制动剂——聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），这会干扰精子核的解凝[7]，不利于胚胎的后续发育；若油压过小则难以将精子吸入显微注射针，而在回吸、破膜时，也会因吸力不足而难以实现破膜，导致精子没有真正进入卵胞浆内，ICSI受精失败。

（2）显微注射针易污染或堵塞。《体外受精-胚胎移植实验室技术》提到，液压传动的显微注射仪，在进行显微注射前应使显微注射针内也充满液体介质（见图2(a)），同时需避免气泡产生[5]（见图2(b)）。对于成熟的生殖中心而言，由于管道内的石蜡油处于不断流动和更新状态，加之工作站内的环境达到百级洁净度，一般不存在针尖污染的情况；但对于新中心而言，油管在不使用时，其一端始终暴露在空气中，时间过长会出现尘埃颗粒或其他液溶胶颗粒黏附管口的情况，而当油液充满注射针时，颗粒物又会随着油液移动到针尖，甚至形成固-液胶体，造成污染[8]。经验丰富的IVF实验室会在显微注射针的中段预留一段空气（见图2(c)），造成显微注射针内液体从针尖至针尾依次为PVP、空气和矿物油，这样能很好地规避管道内石蜡油对针尖造成污染的风险。但PVP是一种具有较好成膜性的物质，与玻璃具有很强的黏附作用，且在空气中暴露一定时间易形成板结和网状结构[9]。对于经验丰富的操作人员能在显微注射针不移出液面的情况下快速完成对十几枚卵子的单精子注射；但对于新建IVF实验室的技术人员，由于操作速度不快，为了尽可能缩短卵母细胞暴露于培养箱外的时间，往往需要以3~5枚卵子为一批，分批实施ICSI显微注射，而这就存在分批操作间隙，前端吸有PVP的显微注射针反复暴露于空气中，随着时间和温度的变化，PVP发生变性堵塞针尖，造成后续注射不畅。

图2 显微注射针内介质填充情况

（3）实验技术人员因实际操作经验不足而影响ICSI操作质量。虽然《卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术规范》[4]要求技术人员在正式实施ICSI前需经过充分的“动物配子和人类配子操作训练”。但由于条件及伦理的限制，IVF实验室在筹备建设阶段是无法获得人类卵子用于ICSI练习，而“对人类配子的操作练习”也仅限于对签署知情同意后男科检查余下的精子进行制动、吸吐和转移练习，且无法练习后续的回吸、破膜、注射和退针；而“动物配子”，所用到的往往是价格便宜且容易获得的实验小鼠的卵子和精子，但小鼠卵子直径仅约为人类卵子直径的1/2，而小鼠的精子头部呈镰刀状，其尾部又极长，对其实施ICSI极易发生崩解[10-11]，模拟练习效果不佳。此外，由于原卫生部颁布的《人类辅助生殖技术规范》明文规定禁止“人类与异种配子的杂交”，故利用人类精子和小鼠的卵子进行ICSI的模拟练习也是绝不允许的。因此，新建IVF实验室的人员在初期会由于没有真正练习过用人类的精卵显微注射而影响ICSI操作的效果。

2 ICSI显微注射操作系统的改进

针对在使用显微注射系统时易碰到显微注射仪液压管路不顺畅、显微注射针易污染或堵塞、实验技术人员操作经验不足影响ICSI效果等问题，浙江大学医学院附属第二医院体外受精实验室对连接了显微注射针的Eppendorf CellTram vario油压式手动显微注射仪的整体通道进行调整改进，并同时做好对操作细节的把控，取得了一定的效果，现将改进经验做如下 分享。

2.1 增加显微注射仪管道内矿物油的更换频次

针对新建IVF实验室易出现显微注射仪某一较长时间段处于非工作状态，进而导致液压管路内的石蜡油滞留堵塞管路的情况，借鉴其他实验室在仪器维护方面的经验[12-14]，增加了对管道内矿物油的更换频次。由原先“临近用完了再加”改为1~2周定期更换新油，即先往“出液”方向转动粗调旋钮，将原先管道内的石蜡油排出，再往“吸液”方向转动旋钮，使活塞退至快速加液阀门的正下方，再向阀门口注入新油，并注意观察注射仪管口的出液情况，确保残留的老油尽数排出，并在实验室质量控制本上进行记录。在进行下一次ICSI操作时，应关注活塞所处管路的相对位置（图3），过于靠前和靠后均会影响吸吐的操作，而临时调整活塞位置需先对显微注射针进行插拔，这容易使针内产生气泡，影响压力输出。

图3 活塞所处管路的相对位置示意图

2.2 合理排布显微注射针内的介质

针对显微注射针全部填充油性介质时针尖易遭受污染，而PVP-空气-油的排布又容易使针尖堵塞的问题，将显微注射针内介质的排布调整为PVP-培养油-空气-矿物油。首先，这样的排布避免了管道内的油进入到针尖，减少了外源性物质导入卵子的风险；其次，PVP与空气交界处加入的这段油液能很好地阻隔PVP与空气的接触（图4），减小PVP液变性结块的发生；此外，在卵子分批搬运的间隙，可以先将针尖前端的PVP排出，与“PVP-空气-油”的排布相比，油层起到了缓冲作用，避免了在排出PVP液的过程中皿内气泡的形成，同时也减小了PVP黏附于玻璃针内壁并板结的发生；最后，由于ICSI的整个过程中显微注射针须反复进出高黏度的PVP液、含血清的HEPES/MOPS缓冲液滴，且在穿刺回吸过程中容易带出卵母细胞的胞质或细胞膜、透明带的碎片，“PVP-培养油-空气-矿物油”中的培养油则能起到润洗针尖的作用。

图4 100倍镜下显微注射针前端介质的排布

2.3 把控好ICSI显微注射的关键细节步骤

注射系统整体通道的顺畅是ICSI成功的前提和必要条件，与此同时，回吸、破膜、注射和退针等细节步骤的正确实施也直接影响到卵子后续的受精及发育。ICSI操作的第一步是精子制动，即通过针尖的按压和撕拉划破精子尾部的包膜，使精子在注入卵母细胞后遗传物质得以释放[15],这一步包括之后的精子的吸取是所有新建IVF实验室筹备阶段练习最多的内容，故基本不存在问题。由于卵母细胞膜具有弹性，即使显微注射针进针处卵膜出现漏斗状（图5(a)），但卵母细胞仍未破裂，此时若实施注射，精子将不能进到卵胞浆内，需有一个回吸确认破膜的过程[5]（图5(b)）。此时，注射系统整体通道内压力的稳定至关重要，油压过大或过小均将导致卵胞质内结构的破坏或ICSI精卵结合的失败。在油压稳定的前提下，回吸、破膜操作可遵循“先快后慢再反向”原则，即先快速向“吸液”方向转动细调旋钮，再放慢速率，这样卵膜易破，而当观察到一个快速反流的过程时，则立即朝相反方向转动旋钮，减小“回吸”对卵胞质内纺锤体和细胞骨架的损伤；注射精子亦不宜过快（图5(c)），因惯性作用，操作太快会导致过多PVP进入卵子；退针的同时可缓慢朝“吸液”方向转动细调旋钮，将多余的PVP再吸回注射针，以尽量减少注入卵胞质内的PVP液。

图5 ICSI显微注射示意图

3 改进前后ICSI效果比较

选取2017年4月—2019年1月男方严重或极少弱精子症来我中心实施ICSI治疗的58个周期，分为改进前组（21个周期共129枚卵子），改进后组（37个周期共233枚卵子），且两组中女方患者生育力各检测值上无显著差异。以ICSI后卵子皱缩或无折光度判定其退化，以ICSI后第二天形成双原核（2PN）判定其受精，以ICSI后第三天细胞数（6~10）、卵裂球大小均匀、形态规则、透明带完整、碎片<25%判定其为优质胚胎，以移植后28天 B超检查见孕囊判定其临床妊娠。利用SPSS 17.,0软件，采用2检验对ICSI后卵子退化率、受精率、优质胚胎形成率以及临床妊娠率进行统计。<0.05表示差异有显著性。对比见表1。

表1 改进前后两组ICSI效果比较

注：与改进前组相比，*<0.05

4 结语

本文结合使用ICSI显微操作系统时碰到的实际问题，给出了增加显微注射仪管道内矿物油的更换频次、合理排布显微注射针内的介质、把控好ICSI显微注射的关键细节步骤等针对性解决方案，并取得了较好的效果，可供其他新建IVF实验室参考借鉴。

[1] STEPTOE P C, EDWARDS RG. Birth after the reimplantation of a human embryo[J]. Lancet, 1978, 2: 366.

[2] 马黔红.辅助生殖技术的新进展[J].中国计划生育和妇产科，2017(1): 4–7.

[3] 王冬颖，樊延军，李丽娟，等.我国人类辅助生殖技术服务机构地域分布与社会经济影响因素初探[J]. 中国妇幼保健，2015(7): 992–994.

[4] 梁珊珊，黄国宁，孙海翔，等.卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术规范[J].生殖医学杂志，2018, 27(11): 1043–1047.

[5] 黄国宁，孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].北京：人民卫生出版社，2012.

[6] 张营霞.显微操作注射针对牛ICSI效率的影响[J].江苏农业科学. 2010(4): 211–214.

[7] JEAN M, MIRALLIE S, BOURDINEAU M, et al. Intracytoplasmic sperm injection with polyvinylpyrrolidone: a potential risk[J]. FertilSteril, 2001, 76(2): 419–420.

[8] 黄雯，王旗. 大气颗粒物化学成分与健康效应的关系及其机制的研究进展[J]. 卫生研究，2012, 41(2): 323–326.

[9] 黄仲英，李尚为，马黔红，等. 降低聚乙烯吡咯烷酮浓度对卵胞浆内单精子显微注射效果的影响[J]. 实用医学杂志，2010, 25(1): 68–70.

[10] 邓利，曾明，匡延平，等. 小鼠卵子胞膜在显微穿刺中存活的膜特性因素研究[J].生殖与避孕，2011, 12(31): 791–796.

[11] COHEN J. A step closer to developing a clinical ICSI model usingmouse oocytes[J]. Reprod Biomed Online, 2010, 21(5): 587–588.

[12] 李祥，赵世杰，刘彬彬. 国家重点实验室大型仪器设备管理与维护探索[J]. 实验技术与管理，2011, 28(12): 185–188.

[13] 毕四军，周保范，李喜玲. 大型仪器设备安全使用与科学规范化管理[J]. 实验技术与管理，2014, 31(5): 262–264.

[14] 唐丽云，席力. 高校大型仪器设备的维护与维修模式研究[J]. 实验技术与管理，2017, 34(12): 290–292.

[15] GERRIS J, MANGELSCHOTS K, VAn BOYEN E, et a1. ICSI and severe male-factor infertility: breaking the sperm tail prior to injection[J].Hum Reprod, 1995, 10(2): 484–486.

Exploration on improvement of microinjection system manipulation in newly constructed in-vitro fertilization laboratory

RAO Jinpeng1, QIU Feng1, CAI Yiting1, JIN Fan2, JIN Min1

(1. In-vitro Fertilization Laboratory, Second Affiliated Hospital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310052, China; 2. Key laboratory of Reproductive Genetics of Ministry of Education, Women’s Hospital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310006, China)

In view of the problem that the microinjection manipulation system can’t run steadily in the newly in-vitro fertilization laboratory, which causes the inadequate effect of oocyte membrane puncture or the damage of oocyte spindle during ICSI, the whole channel of the Eppendorf Cell Tram Vario oil-pressure manual microinjector connected with the microinjection needle is adjusted to improve the stability of egg membrane breakage and single sperm injection. By increasing the replacement frequency of mineral oil in the pipeline of microinjector and adjusting the relative position of piston, the smooth hydraulic system can be ensured. By controlling the medium in the microinjection needle from tip to tail in turn as polyvinylpyrrolidone, culture oil, air and mineral oil, the needle tip is not polluted and blocked, and the rhythm of aspiration, film breaking, injection and needle withdrawal is controlled so that the operation of ICSI can be carried out smoothly. After analysis and improvement, the rate of oocyte degeneration decreases significantly after ICSI（<0.05）, while the fertilization rate, high quality embryo formation rate and clinical pregnancy rate increase.

ICSI; microinjection needle; microinjector; hydraulic system; clinical pregnancy rate

R318.6

B

1002-4956(2019)09-0082-05

2019-01-28

国家自然基金项目（81601268）；浙江省医药卫生科技项目（2019PY028）

饶金鹏（1987—），男，浙江杭州，硕士，实验师，主要研究方向为辅助生殖实验室技术及相关新型工具设计开发。

E-mail: min_jin@zju.edu.cn

金敏（1976—），女，浙江温州，博士，主任医师，主要研究方向为辅助生殖及生殖内分泌。

E-mail:rao_jinpeng@zju.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.021