丁苯酞联合依达拉奉治疗急性缺血性脑卒中对细胞凋亡的影响

陈 盼 张鑫磊 刘震乾 许 静 张 俊

徐州医科大学第二附属医院，江苏 徐州 221000

脑血管疾病是严重威胁人类身体健康的常见病，是导致全球人口死亡的三大原因之一，而在脑血管疾病中，急性缺血性脑卒中具有发病率高、病死率高、致残率高、复发率高的特点，严重影响患者的生活质量，给社会和患者家庭带来沉重负担[1-3]。近年来的流行病学研究表明，急性缺血性脑卒中的发病率和病死率均逐年攀升，并呈现年轻化趋势[4-5]。目前随着缺血性脑卒中溶栓治疗、休克和心肺脑复苏后及围术期心脑血管等手术的开展，对临床可预见性脑缺血/再灌注损伤的防治已成为国内外研究的热点。因此，及时清除缺血/再灌注损伤所引起的氧化应激损伤，并减少氧化应激损伤引起的细胞凋亡是目前研究的重点。依达拉奉是一种脑保护剂，常用于急性缺血性脑卒中患者的治疗[6-7]。丁苯酞是一种新型脑保护药物，近年来在急性缺血性脑卒中患者中的应用逐渐增加[8-10]。本研究将上述两种药物联合用于急性缺血性脑卒中的治疗，观察疗效、氧化应激反应及细胞凋亡的变化。

1 资料与方法

1．1一般资料选择 2018-09-2019-03徐州医科大学第二附属医院收治的急性脑梗死患者 136例，男71例，女65例；年龄 38～79( 56.41±2.99) 岁；病程 6～72( 27.83±2.66) h；根据随机数字表法分为联合用药组和依达拉奉组各68例。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。纳入标准：符合中华医学会神经病学分会脑血管病学组《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》诊断标准；头颅CT或磁共振检查无颅内出血；首次发病；患者参加本研究前未经其他医疗机构治疗；患者及家属知情同意。排除标准：脑出血患者；合并严重心脏、肝、肾功能不全者；合并脑血管畸形或脑肿瘤患者；对本研究所用药物过敏者；不愿配合治疗者。

1．2方法2组均进行基础治疗，包括阿司匹林100 mg/d，瑞舒伐他丁钙片10 mg/d，血塞通注射液0.4 g/d静滴。依达拉奉组加用依达拉奉30 mg+250 mL生理盐水静滴，2次/d。联合用药组除在依达拉奉组基础上加用丁苯酞注射液100 mL(25 mg)静滴，2次/d，共治疗14 d。

1．3观察指标

1．3．1 疗效标准：采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估患者神经功能缺损情况[11]，其高低与神经功能缺损情况呈正相关；采用日常生活能力量表(ADL)评价2组日常生活能力[12]，其与日常生活能力呈正相关。根据NIHSS评分及ADL评分情况判断各组临床疗效。

1．3．2 氧化应激指标：收集病人血液样本5 mL，放入离心机中以1 000 r/min的速度离心，取血清，按照MDA及SOD试剂盒说明书操作，应用酶标仪进行测定。

1．3．3 细胞凋亡指标：收集病人血液样本5 mL，按比例加入蛋白提取液及蛋白酶抑制剂混合，震荡20 min，在4℃、14 000 r/min条件离心10 min，吸取上清液。经电泳转膜后与β-Actin抗体、Bax抗体和Bcl-2抗体反应后通过Image Lab显像。用Image Pro Plus图像软件分析各条带灰度值，以β-Actin为内参计算各组相对表达量。

1．4统计学方法所有数据采用SPSS 18.0统计软件进行处理，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2．12组治疗前后NIHSS、ADL评分比较2组治疗后NIHSS评分均低于治疗前；2组治疗后ADL评分均高于治疗前，联合用药组治疗后NIHSS评分低于依达拉奉组，ADL评分高于依达拉奉组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 2组一般资料比较

表2 2组NIHSS评分和ADL评分比较分)

注：与本组治疗前比较，aP<0.05；与依达拉奉组治疗后比较，bP<0.05

2．22组治疗前后氧化应激指标水平比较2组治疗后MDA水平均低于治疗前，2组治疗后SOD水平均高于治疗前，说明两个实验组的治疗都降低了氧化应激水平。通过2组对比结果显示，联合用药组治疗后MDA水平低于依达拉奉组，SOD水平高于依达拉奉组，说明联合用药降低氧化应激水平的作用更强，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2．32组治疗前后血清bax，bcl-2的蛋白水平比较2组治疗后bax蛋白水平均低于治疗前；2组治疗后bcl-2蛋白水平均高于治疗前，说明两个实验组的治疗都起到了抗细胞凋亡的作用。通过2组对比结果显示，联合用药组治疗后bax蛋白水平低于依达拉奉组，bcl-2蛋白水平高于依达拉奉组，说明联合用药的抗细胞凋亡的作用优于单独用药。差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨论

急性缺血性脑卒中发病过程中脑血流中断和再灌注使脑细胞产生损伤的过程是一个快速的“瀑布式”级联反应，其中包括能量障碍、免疫及炎症反应、活性氧等自由基的大量生成及释放、兴奋性氨基酸释放增加、线粒体功能障碍、细胞内钙超载、 胶质细胞与神经细胞间的相互作用以及凋亡基因的激活等[13-17]。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡[18-19]。有研究表明，氧化应激是脑 I/R 损伤的重要机制之一[20-22]。氧化应激反应中产生的活性氧自由基在脑 I/R 损伤的发生、发展过程中起关键性作用[23-24]。

图1 2组治疗前后氧化应激指标水平Figure 1 Levels of oxidative stress before and after treatment in two groups

图22组治疗前后血清bax，bcl-2的蛋白水平比较

Figure2Comparison of serum bax and bcl-2protein levels before and after treatment in two groups

MDA和SOD是目前公认的脑I/R损伤后能反映氧自由基水平的可靠指标[25]MDA是脂质过氧化反应的终产物，会引起核酸、蛋白质等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒作用[26-28]。SOD是超氧自由基的特异性清除酶，能够明显减少自由基介导的脂质过氧化损伤，稳定溶酶体膜，对细胞起到保护作用[29-30]。因此脑I/R损伤时尽早清除氧自由基，提高SOD活性，减少MDA生成，是减轻脂质过氧化反应减轻脑I/R损伤的关键。当氧化应激反应过强时能通过脂质过氧化作用造成生物膜损伤，使细胞代谢发生障碍、能量耗竭及影响细胞信号转导机制，并最终导致细胞损伤、凋亡。细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制，其中Bcl-2与Bax基因在凋亡过程中发挥重要作用。通过动物和细胞实验研究发现[31-35]，Bc1-2对细胞凋亡具有明显的抑制作用，而Bax可拮抗Bc1-2的作用，从而促进细胞凋亡，因此Bcl-2与Bax的比例决定着细胞受凋亡的进程。

丁苯酞为人工合成的消旋正丁基苯酞，与天然的左旋芹菜甲素的结构相同。临床研究显示[36-40]，丁苯酞对急性缺血性脑卒中患者中枢神经功能的损伤有改善作用，可促进患者神经功能缺损的改善。动物实验也显示[41-46]，丁苯酞可阻断缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节，具有较强的抗脑缺血作用。依达拉奉是一种脑保护剂可清除氧自由基，动物研究显示[47-48]，大鼠在缺血/缺血再灌注后静脉给予依达拉奉，可阻止脑水肿和脑梗死的进展，并缓解所伴随的神经症状，抑制迟发性神经元死亡。

本文结果显示，联合用药组治疗后功能评分优于依达拉奉组，证实联合用药的临床疗效更好；联合用药组MDA水平低于依达拉奉组，SOD水平高于依达拉奉组进一步证实了两种药物联合应用可提高抗氧化应激的能力；本文对药物脑保护作用机制的进一步研究发现联合用药组治疗后血清Bax含量低于依达拉奉组，血清Bcl-2含量高于依达拉奉组，结果说明两种药物联合应用可通过抑制氧化应激反应，上调Bcl-2蛋白表达并抑制Bax蛋白表达，从而达到减轻急性缺血性脑卒中后脑缺血再灌注所引起的脑损伤的效果。