转基因大豆对土壤微生物区系的影响

刘慧璐，范巧兰，王 慧，李永山，席吉龙，杨 娜，席天元，常铁牛，陶民刚

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

大豆最早起源于我国，是重要的油料作物和蛋白来源，因其营养丰富全面，在日常生产生活中扮演着重要角色。自1996 年开始商业化种植以来，转基因作物已连续发展22 a。国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）显示[1]，2017 年转基因作物种植面积创造了1.898 亿hm2的新纪录，种植转基因作物的国家增加到24 个，美国、巴西、阿根廷位列前3。其中，转基因大豆的种植面积最大，超过9 400 万hm2，占转基因作物总面积的50%。大豆总面积的77%为转基因大豆，而抗草甘膦转基因大豆是主要品种。20 世纪我国仍是大豆出口国，但进入21 世纪后我国大豆进出口发生逆转，2018 年全年进口大豆达9 000 万t，是进口量最大的农产品。转基因技术的快速发展，带来了大量的经济效益，解决了许多地区粮食不足的问题；但同时，转基因作物的环境安全性也引起人们的关注[2-6]。

土壤处于岩石圈的表层，与地表环境紧密相连、息息相关。土壤微生物参与土壤物质传递和能量循环，可以表征土壤养分状况和修复污染土壤[7-9]。转基因技术将外源的目的基因转入到本体内，改变了本体的农艺性状或生理代谢，从而实现作物的高产高效[10]。转基因作物大面积种植势必会使得转基因成分或者转基因作物分泌物进入土壤，这可能会引起土壤微生物数量、群落结构和多样性变动，进而影响土壤的生态环境[11]。国内外有很多关于转基因作物对微生物影响的研究，但研究结果存在分歧。有研究结果显示，转基因作物对土壤特定微生物没有影响；而有研究表明，转基因作物改变了土壤微生物群落结构和多样性[12-15]。目前，我国转基因大豆还没有进行商业化生产，但对转基因大豆的生态安全风险已展开相关研究，关于转基因大豆对土壤微生物研究主要集中在东北黑土区[10-11]。但研究的结论不一致。

本试验采用盆栽和传统平板培养计数法结合，对种植耐除草剂转基因大豆的影响进行研究，旨在为转基因大豆的环境安全评价提供一定科学参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为2 个耐除草剂转基因大豆品种TN1和94Y20 以及1 个非转基因大豆品种运豆101。

1.2 试验设计

试验在山西省农业科学院棉花研究所进行，采用盆栽试验。盆栽所用土壤取自农场，土壤类型为黄壤土，速效氮、速效磷、速效钾含量分别为65，7，86 mg/kg，有机质含量0.89%，pH 值7.12，未种植任何转基因作物。试验设3 个处理，每个处理代表一个品种，共有15 次重复。播种前，土壤自然风干，去掉石子、根系等杂质过5 mm 筛，充分混匀。每盆装土7 kg，播前定量浇水，每千克土施用0.15 g N、0.1 g K2O 和0.1 g P2O5。2018 年5 月11 日播种，每盆播种2 粒品质好的种子，出苗后定苗1 株，定期定量浇水，每15 d 变换一次位置，并采取病虫害防治措施。

分别在大豆苗期（6 月25 日）、花期（7 月18 日）、鼓粒期（9 月25 日）和成熟期（10 月9 日）采集根区土样。每盆在根系周围取3 钻，去根系杂质混匀为一个重复，各生育期每个处理取3 次重复。装入密封袋冷藏在4 ℃和－80 ℃冰箱内。

1.3 测定项目及方法

土壤微生物计数采用稀释平板培养法，将土样研磨加入无菌水，逐级稀释至需要的倍数，接种至平板培养基涂抹均匀。采用不同培养基对土壤微生物进行分类，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马丁培养基，放线菌采用高氏一号培养基，固氮菌和氨化细菌采用蛋白胨牛肉膏琼脂培养基（配比不同），详情参考文献[18]。

1.4 数据分析

采用Excel 2010 进行数据整理，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 转基因大豆对土壤细菌的影响

由表1 可知，3 种大豆土壤细菌数量随生育进程逐渐增加，至鼓粒期达到最大，然后降低。其中，苗期，转基因品种94Y20 和TN1 土壤细菌数量比运豆101 分别提高了70.59%和17.65%，但差异不显著；花期细菌数量大小依次为94Y20＞运豆101＞TN1，三者差异不显著；鼓粒期94Y20 和TN1 较运豆101 显著降低了土壤细菌数量；成熟期94Y20 和运豆101 差异不显著，但与TN1 差异均达显著水平。4 个生育期内，转基因大豆TN1 的细菌最少。

表1 转基因大豆对土壤细菌的影响 ×106 cfu/g

2.2 转基因大豆对土壤真菌的影响

从表2 可以看出，转基因大豆94Y20 和非转基因大豆运豆101 土壤真菌数量随生育进程推进呈先增加后减少的变化趋势，至花期达最多；TN1 土壤真菌数量不同生育时期变化不大；苗期TN1 土壤真菌数量高于94Y20 和运豆101，但差异不显著；花期土壤真菌数量运豆101 和94Y20 显著高于TN1，但94Y20 与运豆101 间差异不显著；鼓粒期和成熟期，运豆101 土壤真菌数量略高于转基因品种94Y20 和TN1，但三者差异均未达到显著水平。

表2 转基因大豆对土壤真菌的影响 ×104 cfu/g

2.3 转基因大豆对土壤放线菌的影响

从表3 可以看出，3 个大豆品种放线菌数量随生育进程推进上下波动，表现为先降低之后升高再降低，数量大小依次为鼓粒期＞成熟期＞苗期＞花期；苗期转基因大豆TN1 和94Y20 土壤放线菌数量低于运豆101，但差异不显著；花期，放线菌数量大小依次为TN1＞运豆101＞94Y20；鼓粒期放线菌数量大小依次为TN1＞运豆101＞94Y20；成熟期放线菌数量大小依次为TN1＞94Y20＞运豆101。3 个品种间各生育期差异均未达到显著水平。

表3 转基因大豆对土壤放线菌的影响 ×106 cfu/g

2.4 转基因大豆对土壤固氮菌的影响

由表4 可知，3 种大豆土壤固氮菌数量在生育期内变化趋势相似，苗期转基因大豆94Y20 和TN1与非转基因大豆相比，显著提高了土壤固氮菌数量；其他生育期则相反，转基因大豆品种94Y20 和TN1减少了固氮菌数量，但差异均未达到显著水平。

表4 转基因大豆对土壤固氮菌的影响 ×104 cfu/g

2.5 转基因大豆对土壤氨化细菌的影响

由表5 可知，2 个转基因品种土壤氨化细菌数量随着生育进程推进呈先增加后降低的变化趋势，至鼓粒期达到最高；非转基因品种运豆101 土壤氨化细菌数量也是鼓粒期达到最大值，然后下降。苗期，与非转基因品种运豆101 相比，2 个转基因大豆降低了氨化细菌数量，且差异达到显著水平；花期，土壤氨化细菌大小为TN1＞94Y20＞运豆101，但三者差异未达到显著水平；鼓粒期土壤氨化细菌大小为94Y20＞运豆101＞TN1，但三者差异未达到显著水平；成熟期土壤氨化细菌大小依次为TN1＞运豆101＞94Y20，但三者差异未达到显著性水平。

表5 转基因大豆对土壤氨化细菌的影响 ×105 cfu/g

3 结论与讨论

土壤微生物是土壤生态系统的重要部分，转基因作物对微生物具有潜在的影响。已有研究表明，转入的抗逆等基因可通过作物组织凋落和分泌物渗透的形式进入土壤中[19]，进入微生物细胞内，经过遗传发育可改变微生物的群落结构和多样性[20]；或者转入基因可改变受体的生理活动和农艺性状，基因表达的蛋白组织和生理代谢产生的根系分泌物进入到土壤中，引起根区环境变化，从而对土壤微生物产生影响[20]。

陶波等[21]采用盆栽试验研究转基因大豆对根际和非根际土壤微生物数量的影响，结果发现，不同种植天数转基因大豆与非转基因大豆相比显著增加或者减少微生物数量。刘佳等[22]采用室外小区和平板培养相结合研究发现，转基因大豆降低了土壤细菌、放线菌和氨化细菌数量，提高了真菌数量。沈彬等[23]采用qPCR 和高通量测序研究分析转基因大豆土壤细菌丰度和群落结构，结果发现，转基因的大豆（G10-epsps）对土壤细菌优势种群没有影响，但增加了结荚期细菌的丰度和多样性，改变了部分优势种群的丰度。徐广惠等[17]采用传统培养研究转基因大豆（RRS）对土壤细菌的影响，结果发现，RRS 降低了土壤细菌数量；采用DGGE-cloning方法研究发现，RRS 改变了细菌种群结构，说明转基因大豆对土壤细菌有抑制作用。刘根林等[24]采用磷脂脂肪酸（PLFA）研究发现，转基因大豆改变了花期土壤微生物群落结构。本研究得出，转基因大豆TN1 和94Y20 显著降低了鼓粒期细菌数量，改变了花期土壤真菌数量，这与徐广惠和刘根林研究结果相似。王丽娟等[25]利用Biolog 技术研究转基因大豆大田种植对土壤微生物群落功能多样性的影响，结果表明，转基因大豆（PAT 和ALS）对微生物群落均一度、优势度和碳源利用类型无明显差异，但微生物活性提高。

转基因大豆对土壤放线菌影响不显著，在个别生育期对细菌、真菌、固氮菌和氨化细菌有影响。但由于生态环境的复杂性和微生物群落的多样性，需要结合多种研究方法对土壤微生物进行深入研究，以期得到更可靠的结论。