芦笋对高脂饮食小鼠肠道内容物细菌多样性的影响

彭买姣 惠华英 肖嫩群 谭周进

(湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208)

芦笋是百合科(Liliaceae)天门冬属(AsparagusL.)草本植物，作为食药两用的保健食品，具有很高的营养价值和保健功能[1]。芦笋茎嫰多汁，风味独特[2]，口感较好，深受消费者青睐。此外，芦笋含有游离氨基酸、矿物质、维生素等多种营养成分，以及甾体皂苷、黄酮类、多糖等药用成分[3-5]，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、防止血管硬化、抑制高血压、降低血脂及胆固醇等药理作用[6-7]，其中芦笋多糖和黄酮类化合物作为一种重要的功能因子在抗肿瘤、防衰老等方面发挥着重要作用[8-9]。

高脂饮食中的食物脂肪含量高，长期食用会使体内脂肪水平超过正常范围，易引发健康问题。高脂肪饮食能够引起肠道组织氧化应激发生，改变肠道微生态[10]，诱发身体内部代谢紊乱，导致糖尿病、肥胖等代谢性疾病，而肥胖又易造成心血管及肿瘤等一系列疾患，危害人体健康。肠道菌群是人体代谢的重要参与者，尤其在营养消化、吸收等代谢方面有重要的作用。肠道菌群对人类健康和疾病的影响越来越受到人们的关注[11]。大量研究证实，肠道菌群与肥胖、心血管系统疾病等相关[12]。王勤等[13]研究发现肠道菌群失调在糖尿病的发病过程中起着重要作用，肠道菌群失调会导致肠源性尿毒症毒素的积累。另有研究表明，肠道菌群会影响体脂的沉积造成肥胖，而肥胖会增加患糖尿病、高血压等疾病的风险，进而认为肠道微生物与肠道疾病密切相关[14]。正常情况下，肠道菌群参与人体生命稳态的维持，调控人体多项生理、病理等活动[15]。芦笋具有降血脂的作用[16]，芦笋中强吸附性的纤维素可减小胆固醇、甘油三酯的吸收，从而防止多处心血管疾病的发生。

降脂理肝汤为张云鹏教授治疗非酒精性脂肪性肝病的临床经验方，由泽泻、决明子、丹参、郁金、海藻、荷叶6味中药组成，经验方中重用泽泻降脂理肝，辅以决明子清肝化浊通便，荷叶升清降浊，丹参、郁金活血通络，疏肝经之疲，行肝中之结。临床观察表明，降脂理肝汤具有调脂、护肝和减肥作用[17]。本研究通过对小鼠饲喂高脂饲料，再饲喂芦笋汁、降脂理肝汤，采用高通量测序技术对小鼠肠道菌群16S rDNA V4可变区进行测序，运用QIIME软件比较样品中所含微生物的种类及丰度，旨在阐明芦笋对高脂饮食小鼠肠道微生物多样性的影响，为芦笋及其产品的开发研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物 SPF级昆明小鼠，购自湖南斯莱克斯实验有限公司，雌雄各12 只，体质量约为20 g。动物编号SCXK(湘)2016-0002，在湖南中医药大学动物实验中心饲养。

1.1.2 饲料 正常对照组饲料为纯基础饲料，高脂组饲料为88%的基础饲料中添加2%胆固醇和10%猪油[18]。

1.1.3 药物 将芦笋(山东乳山恒裕食品有限公司)用蒸馏水反复冲洗，吸水纸吸干，将芦笋剪碎，称取60 g并加入10倍水量(质量比，w/w)，煮沸2次，每次30 min，合并2次煮沸溶液，80℃真空浓缩至200 mL，芦笋液浓度为0.30 g·mL-1，备用。

降脂理肝汤：参考文献[19]，称取药材决明子30 g、泽泻10 g、郁金10 g、丹参10 g、荷叶10 g和海藻30 g。加入10倍水煎煮浓缩至0.92 g·mL-1，按比例1∶5.4(v/v)稀释至0.17 g·mL-1。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组 选取SPF级昆明小鼠24只，适应性饲养4 d后，随机分成4组，每组6 只，雌雄各半。分别为正常对照组(bcn)、高脂饮食组(bmn)、高脂饮食芦笋组(bln)及高脂饮食降脂理肝汤组(bjn)。正常对照组喂食基础饲料，其他各组喂食高脂饲料，分笼饲养。

1.2.2 给药方法及用量 将上述分组小鼠按临床剂量等效灌胃给药。高脂饮食芦笋组按2.10 g·kg-1·d-1给药，高脂饮食降脂理肝汤组给药降脂理肝汤浓度为1.19 g·kg-1·d-1，正常组与高脂饮食组每次均给予0.35 mL的蒸馏水，每天2次，固定上下午时间。

1.2.3 小鼠肠道内容物提取 参照Zeng等[20]、Guo等[21]的方法。小鼠饲养40 d后处死，采取无菌操作收集每组空肠至回肠的肠道内容物，充分混匀后立即带回实验室，-80℃保存备用，参照吴海等[22]的方法提取肠道微生物总DNA。

1.2.4 PCR扩增 采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，以提取的DNA为模板，严格控制扩增循环数，使循环数尽可能低的同时，保持扩增条件一致，采用细菌16S rDNA V4可变区进行扩增，电泳检测扩增产物，进一步荧光定量，将各样本按照相应的比例混合。

1.2.5 荧光定量 采用Promega公司(美国)的荧光定量法，将PCR扩增的回收产物进行荧光定量。根据荧光定量结果，将各个样本按照相应比例混合。

1.2.6 MiSeq文库构建及宏基因组测序 测序文库的制备交由Illumina公司(美国)完成，具体操作方法：首先进行序列末端修复，通过AXYGEN公司(美国)的凝胶回收试剂盒中的End Repair Mix2切除DNA序列5′端的突出碱基，同时添加一个磷酸基团，补齐3′端的缺失碱基；在DNA序列的3′端添加A碱基以防止DNA自连，保证目标序列能与测序接头相连，使DNA分子能被固定在Flow Cell上；将接头自连片段去除，PCR扩增DNA片段，添加接头后的文库体系做进一步选择与纯化。

1.3 分析指标

1.3.1 OTU聚类 操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)通常是指根据人工序列相似性阈值将一个或多个样本中的序列归并为一个OTU。将序列进行归并以及划分OTU，可以对不同群落微生物在分类水平进行对比。采用QIIME软件进行OUT归并，优选最佳代表序列[23]。

1.3.2 多样性指数 多种指数均可反映Alpha多样性，但衡量菌群多样性的不同指数的侧重点不一样。其中Shannon指数和Simpson指数为多样性指数，两者皆可反映菌群均匀度，与群落多样性成正比。此外，Chao和ACE(the ACE estimato)为丰富度估计指数，侧重反映菌群的丰富度，同样群落的丰富度与指数大小成正比。

1.3.3 主成分分析 主成分分析(principal component analysis,PCA)主要以降维、简化数据结构为目的，展现样本的自然分布，即将高位数据通过现形变换组合投影到较低纬度的坐标系中。在新的坐标系中，样本间的距离可以最大限度地减小。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，两组间数据比较采用独立样本T检验，P<0.05表示显著差异，P<0.01表示极显著差异；采用R软件制图分析。

2 结果与分析

2.1 宏基因组DNA序列分析

高通量测序过程中，可能产生碱基替换、插入、删除等错误，或产生嵌合体序列。运用QIIME软件对疑问序列进行识别，检查剔除嵌合体序列以确保分析结果的可靠性。具体统计结果见表1和图1，优质序列长度集中在450 bp，可用于后续分析。

2.2 肠道菌群组成的差异

2.2.1 芦笋对高脂饮食小鼠肠道细菌OTU数目和群落结构差异的影响 由图2可知，正常对照组OTU总数有1 264种，高脂饮食组OTU总数有1 564种，高脂饮食降脂理肝汤组OTU总数有1 354种，高脂饮食芦笋组OTU总数有1 654种，且4个试验组共有576种OTU数相同。OTU总数从高到低依次为高脂饮食芦笋组、高脂饮食组、高脂饮食降脂理肝汤组和正常对照组。正常对照组与高脂饮食组共有的OTU数为929个，与高脂饮食降脂理肝汤组共有的OTU数为751个，与高脂饮食芦笋组共有OTU数为859个；高脂饮食组与高脂饮食降脂理肝汤组共有的OTU数为888个，与高脂饮食芦笋组共有的OTU数为1 071 个；高脂饮食芦笋组与高脂饮食降脂理肝汤组共有的OTU数为861个，说明灌胃芦笋液和降脂理肝汤改变了小鼠细菌OTU数目，使肠道菌群的组成结构发生了较大改变。

表1 样品序列数统计表Table 1 Sample sequence number statistics

注：有效序列：index完全匹配的序列。bcn1～3分别是正常对照组1～3; bmn1～3分别是高脂饮食组1～3; bln1～3为高脂饮食芦笋组1～3; bjn1～3分别是高脂饮食降脂理肝汤组1～3。下同。
Note：Effective sequence: Index exactly matching. bcn1-3:Control normal groups 1-3. bmn1-3: High-fat diet groups 1-3. bln1-3: High-fat diet asparagus groups 1-3. bjn1-3: High-fat diet Jiangzhiligan decoction groups 1-3. The same as following.

注：bcn、bmn、bjn、bln分别是正常对照组、高脂饮食组、高脂饮食降脂理肝汤组、高脂饮食芦笋组。下同。Note：bcn: Control normal group. bmn: High-fat diet group. bjn: High-fat diet Jiangzhiligan decoction group. bln: High-fat diet asparagus group. The same as following.图2 OTU维恩图(按97%的相似水平对序列进行OTU的聚类)Fig.2 Venn diagram of OTUs (according to 97% of sequence under the similar level of clustering)

注：两点之间的距离越近，表明样本之间群落结构越相似，差异越小。Note:The closer the distance between two points, the smaller difference of the microbial community.图3 肠道菌群PCA图Fig.3 PCA diagram of intestinal microblota

由图3可知，位于第一、第二象限的高脂饮食组(bmn)分布集中，正常对照组(bcn)位于第二、第三象限，也较为集中，高脂饮食芦笋组(bln)分布在第一、第二、第三象限，高脂饮食降脂理肝汤组(bjn)分布在第二、第三、第四象限，说明高脂饮食使小鼠肠道细菌的均匀度发生了改变，与正常对照组存在差异。高脂饮食芦笋组与高脂饮食降脂理肝汤组中各有2个试验组与正常对照组距离接近，而第三试验组离散程度高，分别位于第一和第四象限。离散的原因可能与小鼠个体体质有关，或组间反应有差异，致使小鼠肠道菌群均匀度降低，表明芦笋和降脂理肝汤能在一定程度上促进高脂饮食小鼠肠道菌群结构的恢复。

2.2.2 芦笋对高脂饮食小鼠肠道细菌多样性指数的影响 Alpha多样性分析能反映特定区域或生态系统内的丰富度和均匀度，从丰富度ACE指数来看，由高到低分别为高脂饮食组、高脂饮食降脂理肝汤组、高脂饮食芦笋组、正常对照组；Chao指数最高为高脂饮食组，其次为高脂饮食降脂理肝汤组、正常对照组、高脂饮食芦笋组，且各组间无显著差异(P> 0.05)，高脂饮食芦笋组与正常对照组的数值最接近。从Shannon指数和Simpson指数来看，肠道细菌多样性从高到低依次为高脂饮食组、高脂饮食降脂理肝汤组、正常对照组、高脂饮食芦笋组，其中高脂饮食芦笋组与高脂饮食组的Shannon指数有显著性差异(P< 0.05)，其余试验组的Simpson和Shannon指数值均无显著差异(P> 0.05)(表2)，表明灌胃芦笋液后菌群结构多样性发生了改变，明显降低了肠道细菌的均匀度。

表2 生物多样性指数表Table 2 Biodiversity indices of all treatment groups

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：Different lowercase letters in the same column indicate significate difference at 0.05 level.

2.2.3 芦笋对高脂饮食小鼠肠道细菌相对丰度的影响 结合各试验组细菌分类门水平的相对丰度分布图(图4)以及表3可知，肠道细菌在门水平，各组从高到低排列后，厚壁菌门(Firmicutes)为正常对照组、高脂饮食降脂理肝汤组、高脂饮食组和高脂饮食芦笋组；变形菌门(Proteobacteria)为高脂饮食组、高脂饮食芦笋组、正常对照组和高脂饮食降脂理肝汤组；放线菌门(Actinobacteria)为降高脂饮食降脂理肝汤组、高脂饮食组、高脂饮食芦笋组、正常对照组；蓝细菌(Cyanobacteria)为高脂饮食芦笋组、高脂饮食降脂理肝汤组、高脂饮食组、正常对照组；拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度从高到低为高脂饮食芦笋组、高脂饮食组、高脂饮食降脂理肝汤组、正常对照组。高脂饮食芦笋组变形菌门、放线菌门的相对丰度介于高脂饮食组与正常对照组之间，高脂饮食降脂理肝汤组厚壁菌门、拟杆菌门相对丰度介于高脂饮食组与正常对照组之间，蓝细菌相对丰度在各组间有差别，规律不明显，且无显著性差异(P> 0.05)。说明在细菌分类门水平，各组间的细菌相对丰度有差别，灌胃芦笋液和降脂理肝汤会影响相应细菌的丰度从而改变小鼠肠道细菌结构。

表3 肠道细菌在门水平的相对丰度统计Table 3 Relative abundance of the gut bacteria at the phylum level

注：横坐标为试验样品，纵坐标为相对丰度。不同颜色代表不同分类单元。每种颜色所在区域的高度代表该分类单元的丰度。Note：The abscissa is the test samples, and the ordinate is the relative abundance. The same color represents the same classification unit. The height of each color area means the abundance of taxa.图4 物种门分布图Fig.4 Distribution of species on the phylum level

3 讨论

中医认为“药疗不如食疗”，食疗用于养生疗疾，已成为现今研究的热点。戴凯群等[24]研究发现杨梅酒对致病菌生长增殖的抑制作用十分明显，为探明杨梅酒中具有抗菌消炎作用的活性成分及其药理作用提供了新线索。丁浩淼等[25]研究羊栖菜多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性，以期开发羊栖菜作为降血糖功能性食品原料。冯翠萍等[26]通过研究芦笋中丰富的纤维素和黄酮化合物发现，其能降低人体血脂胆固醇，预防心血管疾病。为进一步扩大对芦笋及其产品的开发利用，本研究通过对小鼠进行高脂饮食，再与喂食芦笋液、降脂理肝汤及正常对照组进行比较，结果发现，高脂饮食使肠道细菌OTU总数增加，降脂理肝汤促进、芦笋液抑制了高脂饮食小鼠肠道细菌OUT数的恢复，小鼠肠道的细菌种类总数发生了变化，且肠道细菌的组成结构也发生了改变；PCA分析表明，正常对照组集中分布在第二、第三象限，高脂饮食组集中分布在第一、第二象限，高脂饮食芦笋组和高脂饮食降脂理肝汤组与正常对照组距离较近，说明肠道细菌种类及均匀程度都发生了改变，两者均能在一定程度上促进高脂饮食小鼠肠道菌群结构的恢复。Chao、ACE、Shannon及Simpson指数常用于表示肠道细菌群落多样性和丰富度。本研究结果表明，高脂饮食组各指数值均高于正常对照组，表明菌群结构发生了改变，灌胃芦笋液与降脂理肝汤后各指数值趋于恢复正常，高脂饮食芦笋组比高脂饮食降脂理肝汤组效果更明显。

肠道菌群可分为“有益菌”(如乳酸菌和双歧杆菌)、“有害菌”以及“中立菌”(如大肠杆菌)三大类，主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门等组成，“有益菌”可帮助肠道分解消化食物有助于新陈代谢等，而“有害菌”会阻碍肠道代谢，诱发肠炎，肥胖等症。变形菌门数量的增加是生态失调和疾病风险的诊断标志，厚壁菌门和拟杆菌门细菌丰度比值在肥胖人群中明显高于正常人群，厚壁菌门可以将多糖转换为可吸收的单糖类和短链脂肪酸，产生更多可吸收的能源，导致体重增加甚至肥胖[27]。本研究中，从细菌分类门分析，高脂饮食使放线菌门、变形菌门和拟杆菌门相对丰度升高，而蓝细菌升高不明显，厚壁菌门相对丰度降低。高脂饮食小鼠肠道细菌多样性相比正常组在一定程度上有所增加。高脂饮食芦笋组变形菌门、放线菌门相对丰度介于高脂饮食组与正常对照组之间，高脂饮食降脂理肝汤组厚壁菌门、拟杆菌门相对丰度介于高脂饮食组与正常对照组之间，进一步说明芦笋液与降脂理肝汤可通过影响肠道菌群结构及细菌群落多样性达到降低血脂的效果，进而降低脂量。何云山等[28-30]研究发现芦笋对高脂饮食小鼠的脾脏和胸腺等免疫器官具有保护作用，同时还可以降低血脂中甘油三酯含量；此外，芦笋可通过调节高脂饮食小鼠肠道内乳杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌等微生物的结构来调控体脂储存和能量代谢，同时抑制高脂饮食小鼠肠道酶活性从而影响其消化吸收功能，进而影响体重。唐艳强等[31]研究发现芦笋秸秆提取物能够增强蛋鸡肠道消化酶活性，改善肠道形态学结构，促进养分消化吸收，也有一定降脂的作用。本研究在此基础上，采用高通量测序技术，通过Alpha多样性和细菌分类门等比较分析小鼠肠道细菌群落多样性和丰富度，证实芦笋对高脂饮食小鼠肠道内容物细菌多样性产生了影响，通过改变肠道菌群结构能达到降脂效果。本研究创新之处在于能够检测更多菌类。但是研究中发现芦笋液与降脂理肝汤对高脂饮食小鼠肠道细菌多样性影响存在诸多差异，灌胃芦笋液和降脂理肝汤后小鼠肠道细菌在多样性及相对丰度等方面有变化，但无明显规律性，不能更加全面直观地体现肠道菌群多样性对高脂饮食引起肥胖的影响，后期研究还需加大样本量并扩大考察因素范围，进一步研究芦笋降血脂的微生态机理。

4 结论

本研究采用构建高脂饮食的方法进行高通量测序分析芦笋对小鼠肠道内容物细菌多样性的影响，通过与降脂理肝汤进行比较，发现芦笋能影响肠道菌群结构并降低高脂饮食小鼠肠道细菌群落多样性和丰富度，证实芦笋对高脂饮食引起的菌群结构及多样性变化有影响，能使其恢复到正常水平，同时也说明芦笋液与降脂理肝汤通过影响小鼠肠道菌群结构及细菌群落多样性达到了降脂的效果，结合前期研究认为，芦笋对高脂饮食引起的肥胖有一定的减肥效果。本试验仅分析了肠道内容物菌群结构并测定了部分指标，后续研究将继续扩大研究范围，并采用现代分子生物学技术更全面地分析芦笋对肠道微生物的作用机理，为芦笋及其产品的深入开发提供数据和理论支撑。