中西医结合诊治猪支原体和多杀性巴氏杆菌混合感染

罗曼榕，杨忠，刘影波，段博芳，沈学文

（1.云南省动物疫病预防控制中心，云南 昆明 650201；2.云南生物制药有限公司，云南 昆明 650503；3.云南省大理市动物疫病预防控制中心，云南 大理 671003；4.云南省红河州动物疫病预防控制中心，云南 蒙自 661199）

猪支原体肺炎（MPS）是一种慢性呼吸道传染病，由肺炎支原体引起，病猪以干咳和气喘为主要临床表现。该病一般不直接导致猪死亡，但可降低猪的免疫力，使猪继发其他疾病。

多杀性巴氏杆菌（Pm）宿主范围广，正常存在于多种动物的口腔和咽部黏膜，当动物处于应激状态和抵抗力下降时，细菌可大量繁殖并致病。多杀性巴氏杆菌是巴氏杆菌科巴氏杆菌属成员，该菌可引起多种巴氏杆菌病，使动物发生出血性败血症或传染性肺炎。猪巴氏杆菌病的控制主要依赖抗生素，Pm易与其他病毒和细菌发生混合感染或继发感染。

临床常采用中西医结合方法防治动物疾病。许多中草药兼有营养性和药物性作用，具有双向调节功效，可调整和修补整体功能，激活动物体内免疫细胞，提高机体抵抗力，对病毒（或细菌）有极强的抑制、阻断和杀灭作用。

1 材料与方法

1.1 材料药敏纸片、血琼脂培养基、微量生化管。

1.2 器材与试剂气浴恒温震荡器、生物显微镜、LRH系列生化培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、干燥箱、无菌操作台、微量移液器、电子天平、载玻片、接种环、酒精灯、PCR仪、通用引物、Taq酶等。

1.3 病料采集采集病猪肺脏组织用无菌自封袋密封保存。

1.4 试验方法

1.4.1 细菌分离培养病料剪碎放入有灭菌营养肉汤的试管内，封盖贴标签后，置37℃恒温摇床中增菌培养18～24h。将试管内的菌液接种于血琼脂培养基，进行“三区”划线，平板分别放置于厌氧培养箱和37℃恒温培养箱培养18～24 h。将可疑菌落分别放入装有肉汤（1 mL）的2 mL离心管中，于37℃恒温培养箱培养18～24 h。

1.4.2 镜检挑取可疑菌落革兰氏染色，用油镜进行观察。

1.4.3 生化试验将分离纯化出的细菌分别接种于葡萄糖、甘露糖、蔗糖、鼠李糖、乳糖、山梨醇等碳源微量生化鉴定管中，进行糖发酵试验及接种于V-P、MR硝酸盐、吲哚鉴定管中进行相应的生化反应。接种完后置37℃恒温箱培养18～24 h，进行观察、记录。

1.4.4 PCR扩增测序以细菌基因DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物16S rRNA，PCR反应体系25μL，预混DNA聚合酶12.5μL，模板1μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL。

PCR反应条件：95℃5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃90 s，30个循环；72℃10 min；4℃保存。取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，根据通用型DNA纯化回收试剂盒说明书回收目的条带。将胶回收产物送生物工程公司测序，测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对。

1.4.5 药敏试验采用Kirby-Bauer法（K-B法）进行药敏试验，取培养18 h的培养液500μL均匀涂布于固体培养基后，将药敏片贴于表面，37℃恒温培养12～18 h，再用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录结果。

1.4.6 支原体PCR检测无菌采取病死猪肝脏、肺脏、淋巴结研磨、匀浆，提取DNA。用支原体引物对病料组织DNA进行PCR扩增。反应体系总体积 为25μL 2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，模板1μL，ddH2O补至25μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；95℃变性15 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。

2 试验结果

2.1 细菌培养及形态试验表明在需氧和厌氧培养基上均有菌落形成。血琼脂平板上培养24h，有很多白色、圆形的小菌落生成，无溶血现象。分别挑取单个菌落革兰氏染色，镜检，结果见革兰氏阴性菌，其为细小短杆菌，两端钝圆，似椭圆形，单个存在，有时成双排列。

2.2 细菌生化试验结果结果符合多杀性巴氏杆菌的生化特性。

2.3 PCR产物及测序结果PCR扩增目的基因片段大小为1 465 bp，与理论值一致。测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对，表明该分离菌基因序列与已发表的多杀性巴氏杆菌的16S rRNA基因同源性较高，达99%以上。

2.4 药敏试验结果阿米卡星、恩诺沙星为极敏药物；高敏药物有链霉素、多西环素；头孢唑啉、红霉素、克林霉素为中敏药物；青霉素是低敏药物；不敏药物有阿莫西林、氨苄西林。

2.5 支原体抗原检测结果反应结束后取10μL PCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，预期扩增片段长度为500 bp。

紫外灯下观察结果，用凝胶成像系统拍照记录，结果检测出支原体特异性阳性条带。电泳、测序结果与预期扩增片段长度相符，表明病猪有支原体感染。

3 诊断

根据临床症状、病理解剖和病原学检测，确诊病猪为支原体和多杀性巴氏杆菌混合感染。

4 治疗

肌肉注射10%恩诺沙星，2.5 mg/kg，每天一次。中药用车前草10 g、白芍20 g、莱菔子10 g、干姜10 g、当归10 g、党参30 g、茵陈5 g（一头猪2 d量）粉碎拌料喂，一天2次，连用7 d。

5 小结

猪肺炎支原体属条件性致病病原，预防发病主要应加强环境消毒与饲养管理，减少应激。该病多发季节用敏感药物拌料可达防病目的。

猪多杀性巴氏杆菌属条件性致病菌，临床猪巴氏杆菌病常用抗菌药物进行治疗，但抗菌药物的滥用使得细菌的耐药性增强。

许多中草药含丰富的营养物质，如常量元素、微量元素、矿物质、维生素和一些未知的促生长活性物质等。本病例采用车前草清热、祛痰，白芍温阳祛湿，莱菔子消食除胀，降气化痰，干姜温中散寒，回阳通脉，温肺化饮，茵陈散热发表，疏肝清热，当归、党参补益气血，调和诸药，相辅相成。