工厂化生产海鲜菇菌包污染细菌的分离鉴定及防治

赵瑞华， 贺晓龙， 刘月芹， 孙常青

(1.延安大学 生命科学学院， 陕西 延安 716000； 2.陕西省红枣重点实验室， 陕西 延安 716000； 3.陕西瑞福兴生物科技有限公司， 陕西 渭南 714000)

海鲜菇〔Hypsizygusmarmoreus(Peck) H. E. Bigelow〕又名玉蕈和蟹味菇，属担子菌门层菌纲伞菌目白蘑科玉蕈属，形态美观，味道鲜美独特，质地脆嫩，常被称为“假松茸”[1-2]，是一种高蛋白、低脂肪、富含多种矿物质和维生素的保健食品，具有平衡膳食，提高免疫力，延年益寿的功效[3-9]。海鲜菇是我国重要的食药用真菌资源，深受消费者喜爱，产量正逐年提高。但由于生产周期较长，生长速度较慢，抑制杂菌的能力较差，尤其在工厂化生产的任何时期均可能发生杂菌(细菌和霉菌)污染，特别是菌丝生长阶段最易受杂菌污染，因此严重影响海鲜菇的产量与品质，造成巨大经济损失的同时严重影响和阻碍海鲜菇产业的发展[10-17]。加之培养基营养水分充足，如果灭菌不彻底更有利于细菌的生长增殖[18]。食用菌被细菌感染后仍然可以生长，但由于营养物质的流失导致生长缓慢，严重时可导致培养基腐败、有酸臭味，彻底无法生长从而致使栽种失败[19-20]。目前，食用菌栽培污染研究大多是关于霉菌方面的报道，关于海鲜菇工厂化生产污染细菌的研究鲜见报道[21]。鉴于此，笔者对海鲜菇工厂化生产菌包常见细菌病害进行调查，分离纯化病原菌株，采用传统形态学和现代分子生物学手段对污染细菌进行鉴定，并在此基础上探讨常用抑菌药剂对细菌的防治作用，以期为海鲜菇工厂化生产细菌病害的综合防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 海鲜菇菌包 海鲜菇菌包由陕西瑞福兴生物科技有限公司提供，随机采集污染菌包，4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 培养基 培养基均为自制。1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.5 g，NaCl 2.5 g，琼脂20 g，蒸馏水定容1 000 mL，pH 7.2。2) 休和利夫森二氏培养基：蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO40.2 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1 000 mL，1%溴麝香草酚蓝水溶液3 mL，调节pH 7.0～7.4。3) 葡萄糖蛋白胨培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO45 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.4，每管分装4～5 mL。4) PDA培养基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，2%琼脂，加蒸馏水定容至1 000 mL。

1.1.3 试剂 二氧化氯消毒剂，夏县瑶台生物科技有限公司；40%克霉灵可湿性粉剂，湖北随缘食用菌消毒剂有限公司；二氯异氰尿酸钠消毒剂，威岛生物公司；50%多菌灵可湿性粉剂，运城市应用化学厂；新洁尔灭，德州德新康消毒制品有限公司。

1.1.4 仪器设备 VD-650超净工作台，上海力辰仪器科技有限公司；HAD-303A-4恒温培养箱，北京恒奥德仪器仪表有限公司；MiniAmp PCR仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DM500双目生物显微镜，沈阳利昂科技有限公司；CLG全自动高压灭菌锅，致微厦门仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

1) 样品采集。试验用污染菌包于2017年2—4月分3批随机取自陕西省瑞福兴生物科技有限公司的发菌室，被杂菌污染的菌包外观可见明显的病变症状(图1)。

注：1～4，受污染的海鲜菇菌包；5，正常的海鲜菇菌包。

Note: 1～4，contaminatedH.marmoreusfungus packs；5，normalH.marmoreusfungus pack.

图1海鲜菇受污染的菌包样品

Fig.1 Samples of contaminatedH.marmoreusfungus packs

2) 抗菌药剂PDA平板制备。将二氧化氯消毒液、二氯异氰尿酸钠、克霉灵、多菌灵和新洁尔灭溶液稀释成50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL后，分别将其与PDA培养基混匀，制成终浓度分别为50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL的PDA平板备用，以不添加抑菌剂的PDA平板为对照。

1.2.2 污染细菌的分离与鉴定

1) 分离纯化。对污染菌包表面杀菌消毒，切开菌包的发病部位，取污染菌料放入装有灭菌双蒸水的试管中，震荡形成悬浊液，依次稀释成10倍、100倍和1 000倍等不同浓度后，取适量接种到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培养12 h后，观察平板上菌落的生长情况。挑出大小、形态、颜色、表面光泽度、透明度和质地不同的菌落，用划线平板法接种到新的牛肉膏蛋白胨平板培养基上进行纯化，并采用柯赫法则进行验证，每天观察接种海鲜菇菌包的发病情况至菌包外观可见明显病变时结束，并按照上述方法重新分离纯化。

2) 革兰氏染色和生理生化鉴定。先观察平板上细菌菌落特征，再进行革兰氏染色显微镜镜检，然后分别接种于休和利夫森二氏培养基、葡萄糖蛋白胨培养基和牛肉膏蛋白胨培养基(含2%、5%和8% NaCl)测定葡萄糖氧化发酵作用，乙酰甲基甲醇试验(V.P.试验)及耐盐性和需盐性，并记录结果[22]。

3) 16S rDNA分子鉴定。提取各细菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增所用引物为细菌通用引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA

G-3’和5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增后产物委托华大基因进行纯化和序列测定。测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，得到一系列具有一定相似性的16S rDNA序列。下载GenBank数据库中同源性较高的16S rDNA序列与该试验所得细菌的16S rDNA序列对比，确定种属，并利用MEGA 5.10的邻近相邻法计算菌株间的遗传距离，构建系统发育树。

1.2.3 抗菌药剂的筛选 采用单因素试验，每个药剂处理浓度均分别为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。

1) 对污染细菌的抑制作用。用灭菌的直径0.6 cm打孔器在牛肉膏蛋白胨培养基平板上均匀打3个孔，用移液枪吸取稀释成不同浓度梯度的抑菌药剂100 μL加到孔中，然后将各污染细菌菌液接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，涂抹均匀，37℃培养12 h后测量抑菌圈直径大小并分析抗菌药剂的作用效果及相关范围。3次重复。

2) 对海鲜菇菌丝生长的抑制作用。在海鲜菇菌丝的PDA平板上，用打孔器取菌龄相同的菌块(直径0.6 cm)接种于抗菌药剂PDA平板中央位置，25℃避光培养72 h后，采用十字划线法测量菌丝生长速度。根据菌丝生长速度分析抗菌药剂对海鲜菇菌丝生长的抑制作用。3次重复。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 污染细菌的分离鉴定

2.1.1 污染细菌的菌体形态特征和生理生化特性 从表1看出，试验共分离纯化得到6株污染细菌，分别标记为XRA1、XRA2、XRA3、XRB1、XRC1和XRC2。其中，XRA1、XRA2、XRA3和XRB1革兰氏染色为革兰氏阳性细菌(G+)，XRC1和XRC2为革兰氏阴性细菌(G-)；除XRC2菌体形状为球状外，其余菌体形态均为杆状；菌落透明度低，为半透明至不透明；菌落形状XRA1和XRA2为不规则形，其余为圆形且多凸起，颜色各异。从表2看出，将分离到的污染细菌菌株接到相应的生理生化培养基中培养24～48 h后，所有菌株均具有运动性，可发酵葡萄糖，但只有XRA3产气；XRA1、XRA2、XRA3和XRC1在5% NaCl溶液中仍能正常生长，在8% NaCl溶液中6株菌株均不能正常生长。将分离纯化的细菌回接到健康海鲜菇菌包，48 h后开始出现相同污染症状；再次对污染细菌进行分离纯化培养，鉴定细菌为最初海鲜菇的污染菌，符合柯赫法则。

2.1.2 16S rDNA鉴定 6株污染细菌分别用细菌通用引物进行PCR扩增，结果均出现1条大小约1 500 bp较清晰的条带(图2)，与预期值相符，可用于后续测序工作。

表2 海鲜菇污染细菌的生理生化特性

注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性。

Note：“+”and “-”represent positive and negative reactions，respectively.

注：M，DL2000 Marker; 1～6，PCR扩增产物。

Note：M，DL2000 Marker; 1～6，PCR products.

图2海鲜菇污染细菌16S rDNA的PCR扩增产物电泳

Fig.2 Electropherogram of PCR products of 16S rDNA ofH.marmoreuspathogenic bacteria

2.1.3 构建系统发育树 从图3可见，XRA1与芽孢杆菌属(Bacillussp.)、XRA2与萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、XRA3与微小杆菌属(Exiguobacteriumsp.)、XRB1与嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、XRC1与粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、XRC2与粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)的同源相似性分别为98%、99%、98%、98%、98%和98%。结合形态学特征和生理生化特性可以初步得出XRA1、XRA2、XRA3、XRB1、XRC1和XRC2分别属于芽孢杆菌属、萎缩芽孢杆菌、微小杆菌属、嗜热脂肪芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌和粪产碱菌。其中，XRA1和XRA3经过比对目前只鉴定到属。

图3海鲜菇污染细菌菌株基于16S rDNA序列构建的系统发育树

Fig.3 Phylogenetic tree ofH.marmoreuspathogenic bacteria based on 16S rDNA sequence

2.2 海鲜菇污染细菌抗菌药剂的筛选

2.2.1 抗菌药剂对病原细菌的抑菌作用 从表3可见，5种抑菌剂对各病原细菌菌株的影响差异较大，其抑制作用均随处理浓度增加而增强；其中，二氧化氯、二氯异氰尿酸钠和新洁尔灭对污染细菌的抑制作用较强，在低浓度(50 mg/L)时对所有细菌的抑制作用均与对照差异显著；克霉灵和多菌灵对污染细菌的抑制作用较弱，在低浓度(50 mg/L)时对大部分细菌的抑制作用与对照无显著差异，高浓度(200 mg/L)时对部分细菌的抑制作用仍与对照无显著差异。

2.2.2 抗菌药剂对海鲜菇菌丝生长的抑制作用 从表3可见，5种抑菌剂对海鲜菇菌丝生长的抑制作用均随处理浓度增加而增强；在低浓度(50 mg/L)时对海鲜菇菌丝生长的影响处理间及与对照间均无显著差异。当处理浓度>50 mg/L时，对海鲜菇菌丝生长的影响均与对照存在显著差异。相同处理浓度二氧化氯、二氯异氰尿酸钠和新洁尔灭的抑制作用均较克霉灵和多菌灵强。

综上，海鲜菇工厂化生产中可以考虑使用较低浓度(50 mg/L)的二氧化氯、二氯异氰尿酸钠和新洁尔灭抑制杂菌生长，为减少抗药性的发生可选择三者交替使用。

表3 抑菌剂对病原细菌及海鲜菇菌丝生长的抑制作用

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Different letters in the same column indicate 5% significant level.

3 结论与讨论

在海鲜菇工厂化生产的各个阶段均会受到病原菌的侵染，其中培养料受污染影响最为严重。海鲜菇栽培中，病原菌可以通过空气、灭菌不彻底的培养料、带菌的操作环境引入。此外，菇蝇等害虫可能携带有病菌，由此造成病害的侵染传播。

研究首次针对海鲜菇工厂化生产中污染菌包的细菌进行调查分析，共分离得到污染细菌6株，通过形态学、生理生化及分子生物学鉴定，确定其分别为芽孢杆菌属、萎缩芽孢杆菌、微小杆菌属、嗜热脂肪芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌和粪产碱菌，其中，有2株细菌只鉴定到属。污染细菌的种类多样，也给海鲜菇生产中细菌病害的防治带来一定的难度。

目前，在海鲜菇的实际生产中，除了尽量减少细菌污染的可能，抗菌药剂的使用已成为防治食用菌杂菌污染的主要方法之一。研究结果表明，二氧化氯消毒液、二氯异氰尿酸钠、40%克霉灵可湿性粉剂、新洁尔灭和50%多菌灵可湿性粉剂5种杀菌剂对上述几种细菌生长均有抑制作用，但效果存在很大差异。低浓度(50 mg/L)的二氧化氯消毒液、二氯异氰尿酸钠和新洁尔灭对各污染细菌均有较好的抑制作用，且对海鲜菇菌丝生长影响较小，在生产上可选择三者交替使用，以降低菌株抗药性的风险。

试验只对比分析5种抑菌药剂对细菌和海鲜菇菌丝生长的抑制，对海鲜菇孢子萌发的抑制作用、不同细菌对海鲜菇致病性差异及治病机理等均未涉及，还有待进一步研究。另外，该试验浓度是否适合生产中使用，对实际生产海鲜菇的产量、品质是否有影响，是否有农药残留超标，以及实际应用效果等尚待生产检验。