冻存器官和甲醛固定石蜡包埋组织中RNA的定量表达

吕叶辉 ，黎世莹 ，李志宏 ，陶瑞旸 ，3，邵煜 ，胡茜 ，杨智昉 ，陈忆九 ，3

（1.上海健康医学院基础医学院，上海 201318；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610065）

随着生物医学的不断发展及学科融合，核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）这一生物大分子在死亡时间（postmortem interval，PMI）推断、死亡原因分析、不同体液鉴定等方面的相关研究日益深入，已成为法医学研究焦点之一[1-3]。与信使RNA（messenger RNA，mRNA）相比，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）不编码蛋白质，如微小RNA（microRNA，miRNA），其长度只有18～24 nt，在生物体内广泛存在，表达具有组织特异性和高度稳定性，是法医学研究理想的分子标志物[4-5]。

与冻存组织相比，甲醛固定石蜡包埋（formaldehyde-fixed and paraffin-embedded，FFPE）组织能保存多年，是法医病理学实践和回顾性研究中最常使用的样本。随着RNA提取技术的进步，已有研究[6-8]证实在FFPE样本中可提取到一定质量的RNA，并用于下游定量分析。但是，现有研究的FFPE样本主要集中在医院手术取材病理组织，缺乏法医学尸检来源FFPE样本中RNA提取及定量研究的相关报道。因此，本研究以不同PMI的人体组织为研究材料，定量检测管家基因mRNA、miRNA等多种RNA在同一组织冻存样本及FFPE样本中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

9700型PCR仪、7500型实时荧光定量PCR仪（美国AB公司），NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），2100生物分析仪（美国Agilent公司）。

RNAlater保护液（日本TaKaRa公司），TRIzolTMPlus RNA Purification试剂盒（美国Invitrogen公司），RNeasy FFPE试剂盒、miScriptⅡ RT试剂盒、Quanti-Nova SYBR Green PCR试剂盒（德国Qiagen公司），焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水。

1.2 样本收集及总RNA提取

选取4例上海市公安局物证鉴定中心的检案案例，每例均有详细的卷宗记录，编号为1、2、3和4，PMI分别为6h、17h、45h及70h。死者尸体解剖前未经冻融过程，解剖时取脑组织（左额叶皮质）、心肌组织（心尖）及肝组织（左叶），一部分保存在RNAlater保护液中后置于-80℃冻存备用，另一部分进行常规10%甲醛固定（固定时间为20h）、石蜡包埋处理后常规保存备用。本研究方案及样本取材通过伦理委员会审查，并均获得家属知情同意。对于冻存样本，精确称取50g组织按照试剂盒说明书提取总RNA并去除基因组DNA（genomic DNA，gDNA）；对于FFPE样本，保存1年后进行6 μm连续厚切片，每5片放入DEPC水灭菌的微量离心管后，使用RNeasy FFPE试剂盒提取总RNA并去除gDNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测定RNA质量浓度及纯度，分别用ng/μL及260nm和280nm波长下的光密度比值（D260/D280）表示。使用2100生物分析仪测定RNA完整性，用RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）表示，10为RNA完整性最好，0为最差。

1.3 指标选择

本研究选择4种ncRNA作为指标，分别为脑组织特异性微小RNA-125b（microRNA-125b，miR-125b）、心肌组织特异性微小RNA-1（miR-1）、肝组织特异性微小RNA-122（miR-122）及5S核糖体RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）。上述指标的下游引物为通用特异性引物（miScript primer），上游引物（5′→3′）分别为：miR-125b，TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA；miR-1，TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT；miR-122，TGGAG TGTGACAATGGTGTTTG；5S rRNA，TCTCGTCTGAT CTCGGAAGC。此外，选择管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及β-肌动蛋白（β-actin，ACTB），并根据文献[9-10]或设计不同产物长度的引物（较长的用“-L”标识，较短的用“-S”标识），具体如下：GAPDH前引物为共用的CCACATCGCTCAGACACCAT，GAPDHL（323 bp）后 引 物 为 AAGACGCCAGTGGACTCCA，GAPDH-S（71bp）后引物为ACCAGGCGCCCAATACG；ACTB前引物为共用的GCATGGGTCAGAAGGATTCC，ACTB-L（276 bp）后引物为 TGGATAGCAACGTACA TGGC，ACTB-S（58 bp）后引物为 AGGATGCCTCTCT TGCTCTG。

1.4 实时荧光定量反转录聚合酶链反应与标准曲线制备

实时荧光定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：按照说明书，使用miScriptⅡ RT试剂盒对总RNA进行反转录（reverse transcription，RT），合成的互补DNA（complementary DNA，cDNA）置于-20℃备用；使用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，按照试剂盒说明书配制20μL反应体系，并应用7500型实时荧光定量PCR仪进行扩增。每个样本重复3次，结果由系统自动生成，从而得到各RNA指标的循环阈值（cycle threshold，Ct）。

标准曲线制备：分别将4例冻存或FFPE混合样本的cDNA进行10倍连续梯度稀释后作为制备标准曲线的cDNA模板，进行上述qPCR反应并绘制标准曲线。标准曲线的主要参数包括斜率（k）、截距（b）及决定系数（R2），并通过公式E=（10-1/k-1）×100%计算样本的扩增效率（E）。

1.5 统计学分析

运用RefFinder工具[11]对各指标的Ct值进行统计学处理，筛选内参指标，并对其他RNA指标进行内参标准化处理（ΔCt=Ct指标-Ct内参）后，运用2-ΔΔCt法分析各指标的表达情况，使用SPSS 22.0软件对D260/D280、RIN及扩增效率进行统计分析，采用t检验和Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 RNA质量浓度、纯度和完整性

两种样本提取所得的总RNA均经NanoDrop 2000分光光度计测量质量浓度和纯度，结果如下。在冻存样本中，脑组织所提取的RNA质量浓度为608ng/μL，心肌组织为 449 ng/μL，肝组织为 839 ng/μL，均高于FFPE样本所提取的RNA质量浓度［208 ng/μL（脑组织）、132ng/μL（心肌组织）及342ng/μL（肝组织），P＜0.05］。大部分样本RNA的D260/D280值在1.7～2.0，两种样本间差异无统计学意义（P＞0.05），表明所提取的RNA纯度均较高。

每例样本均检测其RIN，结果如图1所示。各组织冻存样本的RIN值与PMI（6h、17h、45h及70h）有关，随着PMI延长逐渐降低。各组织冻存样本的RIN值均明显高于同一组织FFPE样本的RIN值，表明经甲醛固定石蜡包埋处理后，RNA的完整性显著下降。

图1 案例1～4中各组织样本的RIN

2.2 RT-qPCR及扩增效率

在所有组织冻存样本中，对各RNA指标均进行RT-qPCR扩增并获得Ct值，观测其扩增曲线及溶解曲线，扩增曲线为标准“S”形曲线，溶解曲线呈单峰，且多样本重合度高，表明各样本RNA指标均成功特异性扩增。在FFPE样本中，总RNA亦均成功反转录并进行RT-qPCR定量，除GAPDH-L和ACTB-L在部分FFPE样本（3号案例的肝组织及4号案例的3种组织）中Ct值超过检测阈值，其余RNA指标均成功特异性扩增。

扩增效率计算使用标准曲线法，以冻存脑组织miR-125b为例，标准曲线如图2所示，k=-3.349，即miR-125b的扩增效率为98.9%。各RNA指标在不同样本中的平均扩增效率如图3所示。在冻存样本中，各指标的扩增效率都接近理想扩增效率（90%～110%）。在FFPE样本中，组织特异性miRNA和5S rRNA的扩增效率较高，与冻存样本类似；而管家基因mRNA的扩增效率与产物长度有关，GAPDH-S和ACTB-S的扩增效率较为理想，但GAPDH-L和ACTB-L扩增效率较差。

图2 冻存脑组织miR-125b的标准曲线

图3 各指标的扩增效率

2.3 内参指标筛选

在各组织样本中选取理想扩增效率的RNA指标作为候选内参指标，分别为：miR-125b、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（脑组织）；miR-1、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（心肌组织）；miR-122、5S rRNA、GAPDH-S及ACTB-S（肝组织）。运用Ref-Finder软件对上述指标的Ct值进行统计学分析，得到各指标的综合稳定度排序为：脑组织中，ACTB-S＞5S rRNA＞miR-125b＞GAPDH-S；心肌组织中，5S rRNA＞ACTB-S＞miR-1＞GAPDH-S；肝组织中，5S rRNA＞miR-122＞GAPDH-S＞ACTB-S。其中，5S rRNA在各组织中稳定性都相对较高，故选为本研究内参指标。

2.4 定量表达情况分析

对各RNA指标Ct值进行内参标准化处理（ΔCt=Ct指标-Ct5SrRNA），并以1号冻存样本（PMI为6 h）为对照，运用2-ΔΔCt法计算各指标在冻存样本和FFPE样本中的相对表达量。以脑组织ACTB-S为例，其在不同样本中的相对表达量如图4所示，结果表明，同一组织冻存样本和FFPE样本中ACTB-S的相对表达量高度相关（r=0.945，P＜0.05），证实其在FFPE样本中能有效扩增，且其平均相对表达量（0.721±0.239）与冻存样本（0.795±0.232）相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 ACTB-S在脑组织冻存和FFPE样本中的表达情况

相应的，各RNA指标在各组织冻存和FFPE样本中的平均相对表达量如图5所示。

在各组织冻存样本中（特别是肝组织），GAPDHL和ACTB-L的相对表达量均略低于其对应的短扩增产物的GAPDH-S和ACTB-S，进一步证实随PMI延长RNA降解增加、完整性下降。在FFPE样本中，GAPDH-L和ACTB-L的相对表达量较冻存样本显著下降，表明经FFPE处理后RNA降解明显；但是扩增产物较短的GAPDH-S、ACTB-S及各组织特异性miRNA（miR-125b、miR-1和miR-122）的表达情况与冻存样本相比下降不明显。

图5 各RNA指标在冻存和FFPE样本中的相对表达量

3 讨 论

FFPE组织样本是法医病理学研究和实践中重要的材料来源，具有来源充足、可长期保存、疾病类型较多、病理信息丰富等优势。近年来，RNA（特别是小分子miRNA）在死亡原因分析、PMI推断及损伤时间推断等方面的作用也受到法医学者的重视，因此，如能在FFPE样本中提取到高质量的RNA，并准确定量及获取相关基因表达信息，对于上述研究具有重要的科研价值。近年来，随着RNA提取技术的进步和商业化试剂盒的更新，已有研究[12]证实在FFPE样本中可有效提取RNA，并能通过RT-qPCR技术检测各类RNA的表达情况，甚至还可进行高通量分析。此外，法医学尸检组织均经过一定的PMI，而PMI对新鲜（冻存）组织及其对应FFPE样本的影响也值得探究。已有研究[8，13]证实，FFPE样本中RNA的质量与甲醛固定时间和样本保存时间有关，因此，为了对比不同PMI的冻存及同一组织FFPE样本中RNA的质量，并分析管家基因mRNA及ncRNA的定量表达情况，本研究中各样本固定时间与保存时间均是一致的。

提取所得总RNA的质量检测一般分为浓度、纯度与完整性3项。与前期多数研究[14-15]一致，在FFPE样本中提取所得到的RNA浓度低于对应冻存样本，但可满足后续实验用量。纯度分析结果表明，从所有样本中提取得到的RNA纯度均较高，可用于下游反转录及RT-qPCR实验。完整性分析采用RIN表示，在冻存样本中，RIN值随PMI延长而下降，证实RNA随PMI延长会发生不同程度的降解，导致完整性下降。此外，同一案例中，心肌、脑组织的RIN值均高于肝组织，表明肝组织中RNA较易降解，与前期研究[16]结果一致。与冻存样本相比，FFPE样本RNA的完整性相对较低，表明RNA均发生不同程度降解导致完整性下降，分析与甲醛引起RNA与蛋白质交联及化学修饰有关[17-18]。因此，运用RT-qPCR对FFPE样本中各RNA指标进行定量分析时，一定要按照标准的流程进行。

本研究RT-qPCR实验严格按照MIQE指南[19]（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）进行，包括标准化的RNA提取、gDNA去除、选取同样量的RNA进行反转录、标准曲线和溶解曲线检验引物特异性、定量PCR反应3次重复、建立标准曲线计算扩增效率及筛选内参指标等，确保定量结果的准确性和可重复性。为了更好地分析mRNA和ncRNA在FFPE样本中的表达情况，除常用管家基因GAPDH和ACTB外，本研究还选择了3种分别在脑、心肌及肝组织中特异性表达的miRNA及常用的内参指标5S rRNA，上述指标均具有一定的代表性。此外，本研究还对管家基因mRNA指标设计了不同扩增片段的引物，以进一步探究各组织样本中RNA的降解程度及产物长度对定量结果的影响。

RT-qPCR结果表明，除GAPDH-L和ACTB-L在PMI较长（45h及70h）的FFPE样本中未检出外，其余RNA指标均成功扩增并获得Ct值，但是不同RNA指标的扩增效率在冻存样本和FFPE样本中有差异。冻存样本中各RNA指标的扩增效率都较为理想，而FFPE样本中GAPDH-L和ACTB-L的扩增效率较差，这一方面与PCR受到抑制有关[15，20]，另一方面也表明FFPE样本中RNA发生了不同程度的碎片化，片段较小的miRNA及产物长度较短的mRNA指标可有效扩增[9，21]。

RT-qPCR定量分析结果的可靠性与内参指标密切相关，为了筛选出在所有样本均能稳定表达的内参指标，本研究运用能综合分析的RefFinder工具进行筛选，结果表明5S rRNA在所有样本中综合稳定度最高，其表达水平也与各因素无关，是理想的内参指标。之后，对各候选RNA指标进行内参标准化处理，以准确定量各指标在冻存样本和FFPE样本中的表达水平。研究发现，各指标表达情况与其扩增效率有一致性，扩增效率接近理想的RNA指标，其定量结果在两组样本中也高度相关（如脑组织的ACTB-S，r=0.945）。与国内外研究结果[14-15，22]一致，扩增产物较长的管家基因GAPDH-L和ACTB-L在FFPE样本中的表达量显著降低，表明FFPE样本中长链线性RNA的碎片化是不可避免的；而扩增产物较短的mRNA指标（GAPDH-S和ACTB-S）及小分子miRNA，相对不受PMI及FFPE处理的影响，在两组样本中表达具有一致性。

综上所述，尽管FFPE组织样本中的RNA会发生不同程度的降解和碎片化，但通过标准化的RT-qPCR、选取合适的RNA指标及设计合适产物长度的引物，可有效地在组织样本中对管家基因RNA和miRNA进行准确定量，并能在一定程度上反映相关基因的真实表达水平。在后续研究中，本课题组将进一步扩大样本量及扩充指标选择范围，并探讨不同固定时间及保存条件下FFPE样本中RNA的质量及定量表达水平。