接种红色荧光蛋白标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长及结瘤能力的影响

杨晓玫，师尚礼，姚 拓，吕丹彤，李 琦，李 东，杨芮淇，谢华山

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)为一种发光蛋白，1999年首次被报道[1]，其发射波长较长，最大吸收波长和最大发射波长分别为558 nm和583 nm，在紫外线的照射下可直接发射红色荧光，其灵敏度比绿色荧光蛋白(GFP)及青色荧光蛋白(CFP)高，是基于GFP和CFP的一种优良稳定的荧光蛋白[2]。利用大肠杆菌DH5a法和三亲本杂交法成功构建了稳定表达的RFP荧光标记根瘤菌[3]，适度增加了荧光资源，可对不同颜色荧光质粒蛋白同时多部位标记[4-5]。豆科植物固氮效率的高低直接由豆科植物与根瘤菌两者之间基因的相容性决定[6]，田间接种根瘤菌后，土著根瘤菌必然会与外源根瘤菌在生长空间，土壤营养及宿主植物等方面进行竞争，其竞争能力的大小直接影响接种的根瘤菌能否正常结瘤[7]。

目前，国内外对RFP质粒转入苜蓿根瘤菌的研究鲜为报道，已有cfp基因成功导入苜蓿根瘤菌中，并有明显的促生效果[8]。为检测RFP质粒标记后的根瘤菌能否成功侵染苜蓿根系并结瘤，将含有RFP质粒稳定表达的荧光标记根瘤菌接种于紫花苜蓿(Medicagosativa)，观察导入的rfp质粒在苜蓿植物体内能否正常表达，并通过测定回接植株的生物量，结瘤特性和占瘤率探讨优良红色荧光标记株的荧光蛋白表达能力，为研究根瘤菌结瘤固氮能力及根瘤菌与土著菌消长竞争关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

盆栽试验种子发芽率90.6%、甘农5号和WL3436HQ紫花苜蓿净度为98.5%，均来自草业生态系统教育部重点实验室。

试验培养基参照袁全等[9]的方法配制TY(Yeast Tryptone Agar)、参照殷爱华等[10]的方法配制YMA培养基，Hoagland无氮营养液[11]。

出发菌为课题组筛选的高效根瘤菌RhizobiummelilotiGN5(S.LZgn5)、Sinorhizobiummeliloti343(S.LH3436)，购自中国科学院微生物保藏中心的苜蓿中华根瘤菌标准菌Sinorhizobiummeliloti12531(S.12531)。

苜蓿幼苗接菌RFP基因质粒荧光标记根瘤菌菌株：S.LZgn5-rfp2，S.12531-rfp4、S.LH343-rfp3。

1.2 试验方法

1.2.1 种子表面灭菌 取出5粒灭菌甘农5号和WL343HQ苜蓿种子，用无菌水在灭菌三角瓶中将种子洗涤2次，75%的乙醇浸泡3 min，并用无菌水清洗4次。0.1%的HgCl2浸泡3 min，清洗4次。为检测种子表面是否彻底灭菌，将之前的灭菌种子放于YMA培养基，观察有无菌长出。

1.2.2 种子发芽处理 取表面灭菌的供试品种种子均匀置于灭菌培养皿内滤纸上，加入5 mL无菌水28℃避光培养，适时补充水分，待其发芽后选取发芽状况一致的种子备用。实验塑料杯(6 cm×7.5 cm)用75%乙醇处理后杯底扎眼，供给后期苜蓿的生长从下而上的营养液。高温灭菌沙培沙子3 h，150℃高温持续烘干6 h，冷却后分别装于塑料杯中，每标250 g，分别取20粒发芽种子均匀放于每杯中并覆沙20 g。

1.2.3 制备及接种菌液 分别用接种环转接苜蓿根瘤菌及荧光标记菌至100 mL YMA液体培养基中，28℃、120 r/min培养，定期检测其D600 nm值，待值达到0.5～0.8时结束培养备用。

采用每菌株4次重复随机区组[12]进行盆栽试验，并设置不接菌处理作为对照。幼苗长出第一片真叶时，开始在白色培养盘中加入Hoagland无氮营养液。转移已培养好的菌液至离心管离心，去上清留沉淀，加入等体积的无菌水，混合震荡，每个盆栽表面分别浇灌20 mL。水分和营养液需在幼苗生长的整个过程中补充及时。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 苜蓿幼苗生长指标 苜蓿幼苗生长至第46 d，从杯中取出苜蓿幼苗及沙，冲洗干净至根系完整分开，滤纸及时吸干表面水分。

(1)直尺测量苜蓿苗的株高和根长；(2)计数不同处理苜蓿叶片数；(3)采用描形称重法[13]测定苜蓿叶片叶面积，选取植株从下往上第二个分枝中间的叶片3次重复；(4)分析天平分别称量不同处理苜蓿幼苗地上鲜重和根鲜重，3次重复并记数；称鲜重后放于烘箱110℃处理20 min，随后立即80℃连续烘干12 h后称其干重。

1.3.2 苜蓿固氮能力指标测定 (1)测定苜蓿幼苗单株结瘤数；(2)参照李剑峰等[14]5分制的方法划分根瘤等级；(3)测定苜蓿幼苗根瘤固氮酶活性，采用乙炔还原法[15]；切下根系两端0.5 cm处根瘤，并称0.1 g鲜重，放于17 mL西林瓶中，并放入湿润的滤纸片，盖瓶塞并密封，3次重复处理，用微量2 mL无菌注射器抽出1.7 mL瓶内空气，并注入1.7 mL乙炔气体，使其终浓度为10%。室温下反应1 h后，以100 μL进样器抽取西林瓶内气体50 μL，用GC-7890F气相色谱仪测定各处理在1 h内生成的乙烯气体含量(μmol)，参照谭志远等[16]的方法计算植株根瘤的固氮酶活性(μmol/(h·g)；(4)苜蓿幼苗单株根瘤占瘤率的检测。常规方法用灭菌培养皿收集所有根瘤，用荧光显微镜观察表面灭菌的处理的苜蓿幼苗根瘤，荧光标记株侵染产生红色荧光[17]。筛选出固氮酶活性高、占瘤率高且荧光蛋白表达能力高，同时增加苜蓿植株生物量的荧光标记菌株苜蓿幼苗。

1.3.3 测定苜蓿幼苗叶绿素含量 苜蓿幼苗叶片叶绿素含量的测定参照邹琦等[18]的方法，为取苜蓿幼苗各处理长势甚微从上往下第2个分枝的苜蓿叶片，并称取0.1 g剪碎，放于离心管中按方法步骤测定并计算叶绿素含量。

1.4 数据分析

数据结果单因素方差用SPSS 13.0统计软件分析[19]，数据的多重性用Duncan法比较，图表均用Excel 2007制图。

2 结果与分析

2.1 RFP荧光标记菌对2个苜蓿品种幼苗生物量的影响

生物量的大小通过其积累物质能力强弱充分反映，甘农5号苜蓿幼苗接种根瘤菌和接种红色荧光标记根瘤菌后苜蓿幼苗根鲜重及干重、地上部分鲜重及干重均高于未接种的处理。其中，接种S.LH3436、S.12531、S.LZgn5、S.LH3436-rfp3、S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2的苜蓿幼苗根鲜重高出对照15%～77%，根干重高出对照92%～66%，地上鲜重高出对照23%～58%，地上干重高出对照18%～78%，均具有显著差异(P<0.05),表明S.LH3436、S.12531、S.LZgn5及其红色荧光标记根瘤菌具有一定的促生作用(表1)。

接种S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2的甘农5号苜蓿幼苗根鲜重、根干重、地上鲜重和地上干重分别比接种对应根瘤菌S.LH3436，S.12531和S.LZgn5高出2.6%～12.4%，3.2%～13.5%、1.4%～10.2%和1.8%～5.7%，差异均不显著(P<0.05)，表明接种红色荧光标记菌与接种对应根瘤菌相比无显著影响，而与未接种对照相比生物量的增加有明显促进效果，其中S.12531- rfp4表现较好。

表1 甘农5号苜蓿幼苗接种根瘤菌及红色荧光标记根瘤菌的生物量

注：CK表示未进行接种处理，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05).下同

苜蓿幼苗WL343HQ在接种红色荧光标记根瘤菌后生物量均明显提高。其中，苜蓿幼苗根鲜重及干重、地上鲜重及干重分别高出对照33%～73%、92.5%～98.2%、40%～73.4%和53.2%～90.1%，差异均显著(P<0.05)。与接种对应根瘤菌相比，苜蓿幼苗接种S.12531-rfp4后的根鲜重及干重、地上鲜重及干重分别增加了0.42%、9.2%、2%和12%，而接种S.LH3436-rfp3和S.LZgn5-rfp2后的苜蓿幼苗根干鲜重和地上干鲜重有甚微减少，但无显著差异，表明苜蓿幼苗WL343HQ接种红色荧光标记根瘤菌后，不同标记根瘤菌的表现均无显著差异，其中S.LH3436-rfp3表现较好(表2)。

表2 WL343HQ苜蓿幼苗接种根瘤菌及红色荧光标记根瘤菌的生物量

2.2 荧光标记菌及对应出发菌株对两品种苜蓿幼苗根长、株高等的影响

根长、株高、叶片数和叶面积直接影响着植株的生物量高低。甘农5号苜蓿幼苗接种红色荧光标记菌后，增加了苜蓿幼苗根长、株高、叶片数及叶面积的大小，并有显著差异(P<0.05)，其分别高出未接种对照的24.9%～50.4%、30.3%～57.7%、26.5%～44.6%和12%～14.5%。

甘农5号苜蓿幼苗接种S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2后相比接种对应出发菌，接种荧光红色荧光标记根瘤菌苜蓿幼苗的根长、株高、叶片数和叶面积分别高出3%、7.2%、3.66%和4.6%，无显著差异，但接种红色荧光标记苜蓿幼苗的根长高出未接种幼苗的19.7%，差异显著(P<0.05)。其中，S.12531-rfp3表现较好(表3)。

苜蓿幼苗WL343HQ在接种红色荧光标记菌后，幼苗根长、株高、叶片数和叶面积均有增加(表4)，分别高出未接种处理9.2%～48.7%、43.3%～69.9%、18.2%～28.6%和16.1%～24%，有显著差异(P<0.05)。甘农5号苜蓿幼苗接种S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2后的幼苗根长、株高、叶片数和叶面积分别比接种对应根瘤菌的出发菌高出13%、15.1%、11.1%和2.1%，但接种红色荧光质粒的苜蓿幼苗根长高出对照的12.5%，差异显著(P<0.05)。其中，以S.LH3436-rfp3表现较好(表4)。

2.3 荧光标记菌及其出发菌株对两品种苜蓿幼苗固氮能力的影响

测定苜蓿根瘤固氮酶活性的高低是确认有效根瘤菌的传统方法，直接反映苜蓿幼苗根瘤中根瘤菌固氮的能力强弱。甘农5号苜蓿幼苗接种红色荧光标记根瘤菌S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2和接种对应根瘤菌的苜蓿幼苗单株结瘤数、根瘤固氮酶活性和根瘤等级均与未接种对照差异显著(P<0.05)，其中，幼苗根瘤固氮酶活性是未接种处理的9.1～12.2倍，表明接种红色荧光标记根瘤菌能增加根瘤的固氮酶活性，并和接种对应根瘤菌无显著影响，以S.LZgn5-rfp2表现较好(表5)。

表3 甘农5号苜蓿幼苗接种红色荧光标记菌后的根长、株高、叶片数和叶面积

表4 WL343HQ苜蓿幼苗接种红色荧光标记菌后的根长、株高、叶片数和叶面积

表5 甘农5号苜蓿幼苗接种红色荧光标记菌的的单株结瘤数、固氮酶活性、根瘤等级和标记菌占瘤率

注：占瘤率参照文献[24]方法与50%进行比较，即50%为对照，对照的显著水平为50%a

苜蓿幼苗WL343HQ接种红色荧光标记根瘤菌和接种对应根瘤菌后，幼苗WL343HQ相应的单株结瘤数、根瘤固氮酶活性和根瘤等级均与未接种处理差异显著(P<0.05)，其中，根瘤固氮酶活性是未接种的5.1～12倍，试验表明苜蓿幼苗接种红色荧光标记根瘤菌能显著提高根瘤的固氮酶活性，并与接种对应根瘤菌无显著差异。其中，以S.LH3436-rfp3固氮酶活性最高的表现好。

2.4 荧光标记菌及其出发菌株对两品种苜蓿幼苗叶绿素的含量

叶绿素含量的高低反应了光合作用的强弱，也体现了植株利用氮素能力的强弱，RFP荧光标记菌分别接种的甘农5号紫花苜蓿的叶片叶绿素含量比对照高出40.2%～51.2%，差异显著(P<0.05)，苜蓿幼苗接种红色荧光标记根瘤菌及接种对应根瘤菌的叶绿素含量显著高于未接种处理苜蓿(图1)，但接种荧光标记根瘤菌与接种对应根瘤菌的苜蓿幼苗之间叶绿素含量无显著差异。

表6 WL343HQ苜蓿幼苗接种红色荧光标记菌的的单株结瘤数、固氮酶活性、根瘤等级和标记菌占瘤率

图1 红色荧光标记菌接种甘农5号苜蓿幼苗后的叶片叶绿素含量Fig.1 Red fluorescent tags bacteria after inoculation of gannongno.5 after seedling leaf chlorophyll content

RFP荧光标记菌分别接种的紫花苜蓿S.12531的叶片叶绿素含量比对照高出38.2%～47.6%，差异显著(P<0.05)。出发菌和荧光标记根瘤菌的叶绿素含量显著高于未接种苜蓿，而出发菌和荧光标记根瘤菌之间叶绿素含量无显著影响(图2)。

3 讨论

3.1 两个苜蓿品种接种根瘤菌及红色荧光标记根瘤菌生物量及生长指标

苜蓿的生物量和生长指标是直观评价苜蓿品质的最重要因素，众多学者研究结果报道，豆科植物产量可通过接种根瘤菌来增加[20]。目前，国内外都很重视根瘤菌的接种，多个国家在播种苜蓿前均先要进行根瘤菌接种处理，苜蓿在我国农业中有着不可替代的作用，从1981年开始一直筛选苜蓿根瘤菌优良菌株，本研究中，3株根瘤菌与其红色荧光标记菌接种的苜蓿幼苗地上鲜重和干重、根鲜重和干重、根长、株高等均显著(P<0.05)高于未接种苜蓿幼苗，这也符合多位研究学者的成果，得出苜蓿幼苗接种红色荧光标记菌和根瘤菌均对幼苗有明显的促生作用，且红色荧光标记根瘤菌对苜蓿幼苗根系无影响。

图2 红色荧光标记菌接种WL343HQ苜蓿幼苗后的叶片叶绿素含量Fig.2 Red fluorescent tags bacteria after inoculation of WL343HQ after seedling leaf chlorophyll content

苜蓿根长、株高、叶片数和叶面积直接决定苜蓿的质量与产量，而荧光标记的转入不影响苜蓿的正常生长[21]，检测荧光标记菌的占瘤率均不能达到100%，说明存在其他根瘤菌，可能是苜蓿种子里携带的根瘤菌，伴随种子萌发进入土壤根际，成为种子内生根瘤菌。荧光标记根瘤菌侵染苜蓿根系主要取决于根瘤菌细胞和质粒间的适当关系，两者对生存空间和养分供给的不断竞争的能力决定了荧光标记根瘤菌能否在植物根系形成有效根瘤[22-23]。红色荧光蛋白质粒根瘤菌的接种对2种苜蓿的生长均无减缓影响，反而增加了苜蓿各生长指标的标准，对苜蓿品种的差别未有特异性，并有一定的促生效果，这也符合陈力玉等[8]的研究结果，荧光蛋白质粒标记根瘤菌不仅能直观的观测示踪，还可提升苜蓿品质，是一种研究固氮机理等很有效直接的方法，为后期深入研究奠定基础。

3.2 两个苜蓿品种接种根瘤菌及红色荧光标记根瘤菌固氮能力及叶绿素含量

固氮能力和植物叶绿素含量是对苜蓿的品质检测，测定固氮能力等指标对比接种根瘤菌，方可得知红色荧光蛋白质粒对苜蓿幼苗根瘤固氮能力有无影响，是否能继续运用其进行深入研究。试验中，设置表面灭菌且未接种红色荧光的种子盆栽自生根系结瘤为对照组，接种红色荧光蛋白的苜蓿盆栽根系结瘤为实验组，均能在回接红色荧光标记根瘤菌的苜蓿幼苗的根瘤中检测出红色荧光，筛选后的红色荧光标记根瘤菌相比标准无显著差异[24]，红色荧光质粒导入根瘤菌并接种不同品种苜蓿幼苗不影响根瘤菌的竞争结瘤能力，并无负面影响。罗明云等[25]把luxAB基因导入花生根瘤菌中，检测遗传稳定性及回接测定，并得出经过实验结果分析luxAB基因不影响花生根瘤菌的正常生长及功能，试验测定不同品种苜蓿幼苗接种红色荧光标记根瘤菌固氮能力指标及叶绿素含量，可知红色荧光质粒的根瘤菌能成功侵染苜蓿根系并结瘤，能在苜蓿幼苗体内正常表达，并对标记菌的结瘤无影响。

根瘤菌固氮作用固定的氮素提供苜蓿幼苗生长的氮源，而结瘤固氮的前提是共生的有效性，苜蓿幼苗叶片叶绿素含量的多少能表征根瘤菌的共生有效性[26]。S.LH3436，S.12531和S.LZgn5及其红色荧光标记根瘤菌接种的苜蓿叶片叶绿素含量与未接种处理相比有显著差异(P<0.05),且与其对应的根瘤菌叶绿素含量无显著差异，表明红色荧光标记根瘤菌接种不同品种苜蓿后共生有效性良好，并无品种特异性。

4 结论

通过接种红色荧光标记根瘤菌及其对应根瘤菌至甘农5号和WL3436HQ紫花苜蓿，研究其根瘤菌接种苜蓿幼苗的生物量及生长指标，结果表明接种红色荧光标记根瘤菌对苜蓿幼苗的各项指标无不利影响，而表现出一定的促生效果，可促进苜蓿生物量的积累。研究S.LH3436，S.12531和S.LZgn5及其对应红色荧光标记根瘤菌接种苜蓿幼苗与未接种苜蓿幼苗的固氮能力表现，结果表明接种根瘤菌与红色荧光标记根瘤菌均能明显提高苜蓿幼苗的固氮能力，和对应根瘤菌之间无显著差异，以S.LH3436-rfp2和S.LH3436-rfp1较为突出。