高温环境对大鼠学习记忆的影响及其机制研究

高俊涛,冯宪敏,万 朋,骆晓峰,朱文赫,常 影,谢 维,赵国艳,齐佳悦,吕士杰

(1.吉林医药学院基础医学院,吉林 吉林132013;2.吉林医药学院科技处,吉林 吉林132013;3.吉林医药学院直属医院,吉林 吉林132013)

近年来,世界范围内极端天气频发,其中高温天气给人们尤其是高温作业人群的生产生活造成巨大影响。研究表明,高温环境引起体温升高和中枢神经系统损伤,认知能力与高温程度具有相关性[1],高温对注意力[2]、记忆力[3]、处理信息敏锐程度[4]等造成不利影响,并且随着暴露时间的增加而加重[5],但高温环境对学习记忆的影响及其机制仍不明确[6]。高温环境对学习记忆功能的影响以及药物防治方面的报道很少,其作用机制尚不明确。因此,本研究从行为学及分子生物学出发,观察分析高温后大鼠海马区炎症因子的分泌以及炎症因子信号通路上蛋白的表达变化,探讨由神经炎症是否参与高温损伤学习记忆功能的神经调控,旨在为高温损伤大脑认知功能提供新的解释,为相关研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 CREB 一抗(英国Abcam 公司);P-CREB 一抗(英国Abcam 公司);β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司);HRP conjugated(北京中杉金桥生物技术有限公司);BCA 蛋白定量增强型试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);DYY-7C 型电泳仪(北京六一仪器厂);Model680 型酶标仪(美国BIO-RAD 公司);FRESCO17 高速冷冻离心机(美国Thermo 公司);Y 迷宫(成都泰盟科技有限公司);DKB-501S 型超级恒温水浴(上海精宏实验设备有限公司);HITACHI7600 生化分析仪(日本Tokyo 公司)。

1.2 动物分组与处理 雄性清洁级Wistar 大鼠(吉林大学白求恩医学部实验动物中心,动物许可证号:SCXK-吉2016-0003)30 只,体重180~220 g,随机分为正常对照组、模型组各15 只。正常对照组大鼠置于24 ℃室温,模型组大鼠置于43 ℃循环水浴热仓15 min,连续14 d。

1.3 采用Y 迷宫试验 进行学习记忆行为学试验[7,8]。

1.4 蛋白印迹试验(Western Blot)检测大鼠海马组织CREB 蛋白表达 冰上操作取组织,剪碎加组织蛋白裂解液研磨,冰浴裂解30 min,11 500 r/min(4 ℃)离心20 min,吸取上清蛋白液,BCA 法测定蛋白浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5 软件,Y 迷宫试验组间比较进行重复测量数据的方差分析,炎症因子水平、CREB 表达强度组间比较进行单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Y 迷宫自主交替和空间识别 与正常对照组比较,模型组大鼠的实际Alternation 数、最大Alternation 数以及自主交替率都显著低于正常对照组(P<0.01),穿梭次数显著下降(P<0.01),可见高温使大鼠的学习记忆能力明显降低(见表1)。

表1 各组大鼠自主交替率和穿梭次数的比较 (n=15

表1 各组大鼠自主交替率和穿梭次数的比较 (n=15

注:与正常对照组比较,∗:P<0.05,∗∗:P<0.01,下表同

_________组___别__________________________实际Alternati_o_n__数_____________最__大__A_l_te_r_n_a_ti_on___数_______________自__主__交__替__率___________________穿__梭__次_数_______正常对照组 19.78±2.02 29.38±3.28 0.58±0.03 7.12±1.83_________模型组____________________________5.26±1.85∗∗ 10.83±1.55∗∗ 0.31±0.06∗∗ 2.08±1.57∗∗

2.2 Y 迷宫主动回避 与正常对照组比较,模型组大鼠的学习记忆能力的指标包括主动回避错误次数(P<0.05)、辨别错误次数(P<0.01)和训练时间(P<0.01)统计结果均显著升高,而正确次数也显著降低(P<0.01),可见高温环境下大鼠的学习和记忆能力均明显降低(见表2)。

表2 各组大鼠主动回避指标的比较 (n=15,

表2 各组大鼠主动回避指标的比较 (n=15,

_________组___别______________________________主__动__回__避__错__误__/_次______________辨__别__错__误__/_次_________________训__练__时__间__/_分________________记__忆__正__确__次__数_______正常对照组 7.72±2.21 41.18±1.63 51.04±1.70 17.25±1.58_________模型组____________________________26.19±2.15∗∗ 60.30±1.72∗ 112.76±1.53∗∗ 9.31±1.95∗∗

2.3 酶联免疫吸附试验结果 与正常对照组比较,模型组大鼠海马组织中IL-1β(P<0.01)、TNF-α 水平显著升高(P<0.05),说明高温导致炎症因子的升高(见表3)。

表3 各组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α 含量比较(n=15

表3 各组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α 含量比较(n=15

______组___别_______________IL-1β_(_p_g_/m__L_)__________T_N_F__-α_(__p_g_/m__L_)____常温对照组 26.39±1.03 21.65±2.57______模型组______________50.18±3.21∗∗ 55.81±4.35∗

2.4 高温环境降低CREB 蛋白的表达 图1 显示,与正常对照组比较,模型组大鼠海马内磷酸化CREB 表达显著降低(P<0.01),说明高温环境可以影响大鼠的长时程记忆。

3 讨论

图1 各组大鼠海马内的CREB 蛋白表达比较

高温环境导致短暂的或永久性的神经功能损伤,降低认知能力,主要表现在学习记忆能力、推理能力、注意力解决和理解问题能力[9],人体认知功能受损[10],小鼠的学习记忆行为能力明显降低[11-12],但其机制研究不十分清楚。本研究采用Y 迷宫行为学试验,观察高温环境对学习记忆能力的影响,证实了高温环境会导致大鼠学习记忆能力的下降,结果与其他人的研究结果相一致。高温环境可诱导核因子NF-κB 活化[5],使神经胶质细胞激活,迁移到受损区域,活化的神经胶质细胞释放炎性分子和细胞毒性因子,如环氧酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)衍生物,肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL-1β)等[13],进而导致神经元和突触损伤,TNF-α 和IL-1β 抑制成体神经干细胞的增殖和认知功能[14]。神经炎症因子上调所致学习记忆功能的下降越来越引起人们的关注,其中IL-1β、TNF-α 作为分泌的主要致炎因子,其升高是致使学习记忆能力下降的一个重要机制。高温环境可显著增加海马炎症反应[5],导致记忆障碍,与本实验结果相一致。本试验研究发现,高温环境下大鼠海马组织内的炎症因子IL-1β、TNF-α的表达含量也升高,可见高温环境介导的神经炎症反应参与学习记忆下降的神经调控过程。与此同时,学习记忆相关分子蛋白CREB 含量却下降,CREB 是cAMP 反应单元的一种蛋白质,调控着基因的表达,被称为是记忆的“开关”,CREB 与学习、记忆和树突传输密切相关。脑缺血损伤后,大鼠的学习记忆能力下降,CREB 磷酸化水平下降。此外脑缺血导致海马CREB 活性降低引起学习记忆功能障碍。 CREB 敲除小鼠,记忆功能损伤,学习时CREB 活性是神经元参与记忆功能的关键因素[15]。上述结果提示,神经炎症反应可能参与高温环境降低学习记忆能力的神经生物学过程,高温环境可通过抑制CREB 的磷酸化,导致学习记忆下降。海马组织中的神经递质、激素及其他蛋白的改变是否与高温环境导致的学习记忆功能损伤有关,尚有待进一步研究。