基于网络药理学的“苍术-黄柏”药对治疗痛风作用机制研究Δ

张思旋，林 茜，吴嘉瑞，孟子琦，张景媛，黄星月

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

苍术苦温、燥湿，黄柏苦寒、清热燥湿，两药合用则清热燥湿之力较强，为治疗湿热诸症的常用药对[1]，源于《丹溪心法》的二妙散[2]。苍术为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎；功能为燥湿健脾、祛风散寒、明目；用于湿阻中焦、脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿蹙、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲及眼目昏涩。黄柏为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮；功能为清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮；用于湿热泻痢、黄疸尿赤、带下阴痒、热淋涩痛、脚气痿蹙、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒、湿疹湿疮、阴虚火旺及盗汗骨蒸[3-4]。

痛风在中医理论中属“痹病”范畴，元代朱丹溪提出“痛风者，四肢百节走通，方书谓之白虎历节风证是也”。西医理论中，痛风是因体内嘌呤类物质代谢障碍或肾脏尿酸排泄减少致血尿酸浓度持续增高形成尿酸盐结晶并沉积至软组织所诱发的一系列炎症反应，当血清中尿酸浓度升高至超饱和状态时则由细胞外液沉积于关节、关节周围组织及器官，其临床特点为高尿酸血症、反复发作的痛风性急性关节炎、间质性肾炎和痛风石形成，严重者伴有关节畸形或尿酸性尿路结石。痛风性关节炎常为该综合征的首发表现，早期以单关节复发急性炎症为特征，进一步恶化出现多关节炎的频繁或持续发作，长期将引起关节畸形、肾结石和肾衰竭等疾病[5-6]。

历代至现今的诸多医家使用苍术、黄柏配伍并进行加减以治疗痹症，并有文献研究采用数据挖掘的方法得出苍术、黄柏配伍有明显的抗痛风作用的结论[4]。随着现代医药学的发展，“苍术-黄柏”药对治疗痛风的作用机制研究已初步进入分子生物学水平，但应用网络药理学方法在系统层面对其治疗痛风的作用机制的研究依然较少。不同于化学药的药理特征通常为单一成分及靶点[7]，中药具有多组分、多靶标和多途径协同作用的特点，因此，很难阐释清楚其物质基础及作用原理，而网络药理学的出现为中药的研究提供了全新的视角。网络药理学是在现代药理学研究基础上提出的药物设计与开发的新方法和新策略，其以系统生物学为基础，从系统层次分析以了解疾病的发病机制，从整体水平观察“药物-靶点-疾病”复杂网络关系，进而指导新药研发及药理作用研究[8]。网络药理学把之前“一个靶点，一种成分”的药物研究模式转变为“多靶点，多成分”的新模式，从而能够更好地揭示中药多成分、多靶点之间的复杂关系；因中药复杂的作用机制，使对其发挥作用的机制的深入研究遇到巨大阻碍，而网络药理学为复杂中药系统的研究提供了新的思路和切入点[9]。网络药理学的研究策略具有的整体性和系统性与中医药的辨证论治原则、整体观念不谋而合，可用于发现复杂中药中的活性成分，进而识别靶标和预测适应证[8,10]。本研究采用网络药理学方法，预测、分析“苍术-黄柏”药对治疗痛风的分子作用机制，希望为深入开展“苍术-黄柏”药对治疗痛风的基础实验研究及临床合理应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 “苍术-黄柏”药对活性成分及对应靶点的收集

中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集了来自于《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)中499种草药的组分数据，涵盖13 144个分子以及29 384个化合物，所述分子数据均由研究组成员经过数年的手动验证添加，是世界上最大的非商业中药分子数据库之一[11]。TCMSP主要包含分子数据集、靶点识别系统、分子与靶点间相互作用网络、靶点与相关疾病间相互作用网络信息以及口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、类药性(drug-likeness，DL)、小肠上皮通透性和溶解度等信息。选取苍术、黄柏中含有的活性成分为对象进行研究，通过TCMSP查找并导出用于筛选活性成分的相应数据。经过设置OB≥30%、DL≥0.18，筛选出共30个活性成分。再将其依次输入TCMSP，查找相应的靶点，共得到220个潜在靶点。

1.2 “苍术-黄柏”药对“活性成分-预测靶点”网络的构建

Cytoscape 3.6.1(http：//www.cytoscape.org/)是一款开源的生物信息分析软件，用于构建由蛋白质、基因和药物等相互作用构成的分子交互网络，实现可视化浏览和分析[12]。将“苍术-黄柏”药对的化合物和相关靶点导入Cytoscape 3.6.1，从而构建“活性成分-预测靶点”网络。

1.3 痛风相关的靶标蛋白质的收集

治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp)是一个提供已知或正在探索的可用作治疗的蛋白质靶点和核苷酸靶点的信息，以及与之相对应的靶疾病、靶通路和相应的药物/配体信息的数据库[13]。以“Gout”为关键词进行捜索，收集与痛风相关的蛋白，由于该数据库得到的靶点较少，因此合并遗传关联数据库(genetic association database，GAD)(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)，得到与痛风相关的靶点信息。

1.4 痛风相关的蛋白互作网络构建

STRING 10.5数据库(http：//string-db.org)是一个储存已知的和预测的蛋白质相互作用的数据库，包含蛋白质间直接的和间接的相互作用，其对每个蛋白质相互作用信息都进行打分，分值越高说明蛋白质的相互作用置信度越高[14]。将TTD、GAD中收集到的与痛风相关的所有蛋白质导入STRING数据库并导出分值>0.7的高置信度蛋白相互作用数据，用Cytoscape 3.6.1构建与痛风有关的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。

1.5 网络合并

利用Cytoscape 3.6.1中Merge功能，将“苍术-黄柏”药对“活性成分-预测靶点”网络与痛风的PPI网络合并，确定两者是否存在交集，存在交集的蛋白质很有可能是“苍术-黄柏”药对的活性成分治疗痛风的潜在作用靶点。通过Cytoscape 3.6.1构建“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络，系统分析“苍术-黄柏”药对治疗痛风的潜在作用靶点。

1.6 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

为了说明“苍术-黄柏”药对治疗痛风的潜在作用靶点在信号通路中的作用，采用David v6.8数据库(https：//davidd.ncifcrf.gov/home.jsp)[15]，对与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络中的蛋白进行基于KEGG的生物通路富集分析，并利用OmicShare对通路进行可视化。为了说明中药化合物的靶点蛋白在基因功能中的作用，采用David v6.8数据库，对与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络中的蛋白进行GO功能富集分析。

2 结果

2.1 “苍术-黄柏”药对“活性成分-预测靶点”网络

“苍术-黄柏”药对中含有的30个活性成分基本信息见表1，其中4个来自苍术，26个来自黄柏。“活性成分-预测靶点”网络总共包括250个节点，组成547条“活性成分-预测靶点”联系，见图1；图中，三角形表示苍术的活性成分，菱形表示只有苍术对应的预测靶点，六边形表示黄柏的活性成分，圆形表示只有黄柏对应的预测靶点，八边形表示苍术和黄柏共同对应的预测靶点。

表1 “苍术-黄柏”药对30个活性成分基本信息Tab 1 General information of 30 active ingredients of “Atractylodis Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex”

图1 “苍术-黄柏”药对“活性成分-预测靶点”网络Fig 1 Active ingredients-predicted target network of “Atractylodis Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex”

2.2 痛风相关的PPI网络

TTD中检索到17个与痛风相关的蛋白，GAD中检索到67个与痛风相关的蛋白，两者有部分重合，删除重复部分后共有52个与痛风相关的蛋白。检索PPI数据，随后构建与痛风相关的PPI网络，其中包含140个与痛风相关的蛋白和1 452条与痛风相关的PPI关系，见图2。

图2 与痛风相关的 PPI 网络Fig 2 Gout-related PPI network

图3 与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络Fig 3 Active ingredients-potential target network of “Atractylodis Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex” in the treatment of gout

2.3 与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络

将“苍术-黄柏”药对“活性成分-预测靶点”网络和与痛风相关的PPI网络导入Cytoscape软件中，用Merge功能两者合并，得到“苍术-黄柏”药对中活性成分治疗痛风的潜在靶点，并构建与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络，见图3。图中共包括39个节点(23个圆形的化合物节点、17个八边形的靶点节点)和55条边。17个靶点分别为前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、核受体辅激活蛋白1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、醇醛酮还原酶家族1(aldo-keto reductases 1 B1，AKR1B1)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase，XDH)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)、白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白细胞介素1α(interleukin 1 α，IL-1α)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、磷酸化IKB alpha抗体(NFKBIA)、糖皮质激素受体基因(NR3C1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2抗体(ABCG2)、蛋白激酶(AKT1)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亚基γ亚型(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PIK3CG)、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)。运用Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network，对与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络进行分析，得到网络中潜在靶点的度值，靶点的度值表示“苍术-黄柏”药对活性成分可能作用于该靶点的个数；度值越大，“苍术-黄柏”药对活性成分通过该靶点发挥作用的可能性就越大。本研究中，有4个靶点的度值大于平均度值(4.17)，意味着其很可能是“苍术-黄柏”药对活性成分发挥作用的潜在靶点。

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID平台进行GO功能富集分析，对与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络中涉及的17个蛋白在基因功能中的作用进行研究。根据P值确定了149个GO条目(P<0.001，根据P值列出前27个，见图4)；其中，生物过程相关的条目最多，有105个，主要涉及有机物质反应、基因表达过程的调节、分子功能及活性的调控、级联反应、细胞坏死以及凋亡的调控等方面；分子功能相关的条目35个，主要涉及分子及受体活性、酶结合、受体结合及信号转导等方面；细胞组成相关的条目9个，主要涉及细胞组分、细胞质膜和细胞器等方面。再利用DAVID平台的KEGG通路富集分析功能，对与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络中涉及的17个蛋白在信号通路中的作用进行研究，得到59条信号通路，根据P<0.001筛选出23条(见图5)；包括“TNF signaling pathway”(TNF信号通路)、“Osteoclast differentiation”(破骨细胞分化)、“Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)”[非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)]、“Influenza A”(甲型流感)、“Chagas disease(American trypanosomiasis)”[南美锥虫病(美洲锥虫病)]、“Toll-like receptor signaling pathway”(Toll样受体信号通路)、“Insulin resistance”(胰岛素抵抗)、“Measles”(麻疹)、“Leishmaniasis”(利什曼病)、“Graft-versus-host disease”(移植物抗宿主病)、“Hepatitis C”(丙型肝炎)、“Legionellosis”(军团病)、“NOD-like receptor signaling pathway”(NOD样受体信号通路)、“Regulation of lipolysis in adipocytes”(调节细胞脂肪分解)、“Hepatitis B”(乙型肝炎)、“Apoptosis”(细胞凋亡)、“Inflammatory bowel disease(IBD)”[炎症性肠病(IBD)]、“Adipocytokine signaling pathway”(脂肪细胞因子信号通路)、“Tuberculosis”(结核)、“Pertussis”(百日咳)、“Small cell lung cancer”(小细胞肺癌)、“Hematopoietic cell lineage”(造血细胞谱系)、“NF-kappa B signaling pathway”(核转录因子κB信号通路)。

图4 17个潜在作用靶点的GO功能富集分析(P<0.001)Fig 4 GO function enrichment analysis of 17 potential targets(P<0.001)

图5 17 个潜在作用靶点的KEGG通路富集分析(P<0.001)Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis of 17 potential targets(P<0.001)

2.5 药物-化合物-靶点-通路图的构建

图6 药物-化合物-靶点-通路图Fig 6 Drug-compound-target-pathway network

基于上述信息，构建药物-化合物-靶点-通路图，以全面阐述“苍术-黄柏”药对治疗痛风的作用机制，见图6；图中，三角形节点分别代表苍术和黄柏，菱形节点代表苍术的活性成分，八边形节点代表黄柏的活性成分，正方形节点代表苍术与黄柏活性成分共同对应的靶点，圆形节点代表黄柏独有的靶点，六边形节点代表苍术独有的靶点，箭头形节点代表所有靶点参与的通路。

3 讨论

不同国家及地区的痛风患病率不同[16]。在我国，痛风呈现出高患病率、低治疗率以及高并发症发生率的特点[17-20]。

苍术、黄柏为治疗湿热诸症的常用药对。现代药理研究结果表明，苍术中主要含有倍半萜类、烯炔类、三萜及甾体类、芳香苷类等化学成分；与其对应的药理活性研究结果表明，上述成分在保肝、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、中枢抑制及促进胃肠道蠕动、抗溃疡和抑制胃酸分泌等方面具有一定作用[21-22]。黄柏在降血糖、抗菌、抗肿瘤[23]以及自身免疫调节[24]等方面具有显著作用。苍术、黄柏配伍使用组成《丹溪心法》二妙散，该方药仅2味，但功效卓著，作用神妙，为治湿热痿证的妙药，故名“二妙散”。二妙散的现代药理作用主要有抗菌、镇静、降血糖、解毒、利胆和对胃肠的影响等[25]。苍术所含的挥发油有祛风健胃作用[26]；苍术挥发油中的成分具有降血压、利尿、促进胃排空和抗炎等作用。黄柏具有降血糖、降血压、抗菌、抗炎、解热、抗肿瘤、抗溃疡、抗氧化、抗痛风、前列腺渗透和抗病毒等药理作用，并对肠管和免疫系统均有影响[27]。现代研究结果表明，苍术、黄柏配伍后可对二者单用的功效进行补充，同时不同配伍比例的抗炎作用具有差异[28-29]。

本研究先构建“苍术-黄柏”药对“活性成分-预测靶点”网络，再构建与痛风相关的PPI网络，然后将二者进行重合筛选，构建与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络，系统分析“苍术-黄柏”药对治疗痛风的作用机制。与痛风相关的“苍术-黄柏”药对“活性成分-潜在靶点”网络中度值大于均值的关键靶点有4个，分别为ESR1、PTGS1、PTGS2和PIK3CG，推测“苍术-黄柏”药对的有效成分可能通过这些靶点发挥作用。(1)ESR1是雌激素受体的2种主要类型之一，在不同程度的器官系统的生理发育和功能中发挥一定作用，包括生殖系统、中枢神经系统、骨骼系统和心血管系统[30]。在骨骼系统中，ESR1的表达适中，但可以确定其生理功能为维护骨骼的完整性[31-32]。这可能是因为雌激素刺激ESR1而触发释放生长因子，如表皮生长因子、胰岛素样生长因子1等，进而调节骨开发和维护[31-33]。此外，有研究结果表明，该靶点与风湿病有明显的关联[34]，推测痛风也与该靶点有关。因此，推断“苍术-黄柏”药对治疗痛风的作用机制可能与调控ESR1的表达有关。(2)前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)是生物体内前列腺素(prostaglandin，PG)合成起始步骤的限速酶[35]。PG是一类重要的炎性介质，在各种急慢性炎症中发挥着重要作用[36]。PTGS存在2种同功酶，即组成型(PTGS1)和诱导型(PTGS2)[37]，两者在表达水平、基因调控和分子特性上都有极显著的区别。国内外学者普遍认为PTGS1为管家酶，在全身器官均有表达；而PTGS2是经刺激迅速产生的诱导酶，正常情况下仅见于肾和大脑的部分区域[38]。PTGS1参与机体正常生理过程和保护功能，如维持胃肠勃膜完整性、调节血小板功能和肾血流[35]；其作用为调节血管生成过程中的内皮细胞，并参与细胞信号传导和维持组织稳态。PTGS2是肿瘤、恶性肿瘤和炎症形成的促进剂[39]；在组织损伤或炎症情况下，可在一系列胞内和胞外促炎因子[如白细胞介素-1(IL-1)、生长因子及TNF等]刺激下迅速表达，催化合成的PG参与炎症反应[35，38]。在临床应用中，已经开发出选择性非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAID)，其为一类不含有甾体结构的抗炎药，用于解热、镇痛及消炎，是治疗急性痛风的有效药物；相较于传统非选择性NSAID，其胃肠道毒性、肝肾损伤的不良反应发生概率降低，但疗效与非选择性NSAID相当。其作用机制是抑制PTGS，尤其是PTGS2的活性而发挥抗炎作用，但因其同时会抑制部分PTGS1而出现一定的胃肠道等不良反应[40]。对于ESR1、PTGS1及PTGS2与痛风的形成机制已有一定研究，但对于PIK3CG与痛风形成的机制还有待进一步研究。而上述4个靶点在苍术、黄柏配伍治疗痛风相关研究中的报道很少，大部分集中在治疗恶性肿瘤、冠心病等方面，偶有炎症反应方面的报道。痛风为以炎症反应为主的疾病，以上研究可以初步证明上述4个靶点与痛风的形成与治疗有关，有待进一步验证。

KEGG通路富集分析中，筛选得到23条信号通路，其中包括TNF信号通路、破骨细胞分化、NAFLD、甲型流感、南美锥虫病(美洲锥虫病)、Toll样受体信号通路、胰岛素抵抗、麻疹、利什曼病、移植物抗宿主病、丙型肝炎、军团病、NOD样受体信号通路、调节细胞脂肪分解、乙型肝炎、细胞凋亡、IBD、脂肪细胞因子信号通路、结核、百日咳、小细胞肺癌、造血细胞谱系及NF-κB信号通路。(1)破骨细胞为多核巨细胞，来自于单核-巨噬细胞谱系的造血祖细胞，仅存在于骨中。成骨细胞通过与破骨细胞祖细胞的细胞间接触，参与破骨形成。类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞和活化的T淋巴细胞表达破骨细胞分化因子/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，最近有研究结果表明，RANKL能够阐明造骨细胞调节骨吸收的精确机制，这似乎也会引发类风湿关节炎中的骨破坏[41]。由此推测，破骨细胞分化通路和NF-κB信号通路的共同调节与同为风湿性疾病的痛风的形成有关。(2)血液尿酸浓度升高，综合患者体质等原因，尿酸会沉积在关节处。一旦沉积，其可促进与炎症相关的级联反应，并最终导致痛风发作[42]。TNF-α为体内与炎症反应相关的细胞因子，其产生途径与多种蛋白产生的级联效应有关[43]。Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是跨膜受体，其细胞外的N端有一个富含重复亮氨酸(leucine rich repeat，LRR)的结构区域[44]，细胞内的C端被称为Toll/IL-1受体结构域(toll-IL-1 receptor domain，TIR)，而LRR与配体的结合与TLR二聚体有关。TIR区域介导TLR与信号转导原件之间的相互作用。活化后的TLR通过TIR与髓样分化分子88结合形成复合物，之后结合并活化IL-1受体相关激酶(IL-1R-associated kinase，IRAK)；随后结合TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)[45]，活化转化生长因子β活化激酶1(TGF β-activated kinase 1，TAK1)，进而激活NF-κB，启动前炎性IL-1β的表达，产生炎症级联反应，从而产生TNF-α等细胞炎性因子[46-48]；且激活的NF-κB能够转运到核内与PTGS2基因启动子区的NF-κB结合位点相结合，并调节PTGS2基因的表达[49]。由此，可以推测TNF信号通路、NF-κB信号通路和Toll样受体信号通路的共同调节与痛风的形成相关。(3)NAFLD是一种组织学改变与酒精性脂肪肝相类似的临床病理综合征[50]。多数研究者认为，其发病机制与肥胖、高脂血症及胰岛素抵抗等相关[51-52]。但目前广泛认可的仍是“二次打击”学说，即一系列的细胞毒素事件后的炎症反应。第一次打击(脂类在肝细胞的细胞质内聚集)引发一系列的第二次打击(细胞毒素事件)，导致肝脏的炎症反应。NAFLD的发生与发展主要包括胰岛素、瘦素抵抗，游离自由基的大量产生，内脏脂肪的过多堆积和肝脏组织的炎症反应等[53]。由此推测，NAFLD与痛风的炎症反应形成相关。以上是研究过程中体现出的与痛风的形成机制相关度较高的几条体内信号通路的现代研究，推测“苍术-黄柏”药对活性成分可能通过作用于这些信号通路中的关键因子达到治疗痛风的目的。整体上，“苍术-黄柏”药对活性成分调控信号通路治疗痛风的相关研究报道十分有限，有待进一步深入研究。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对“苍术-黄柏”药对治疗痛风的多成分、多靶点和多途径的复杂网状关系进行研究。研究结果初步预测了“苍术-黄柏”药对治疗痛风的分子机制，为进一步深入探讨或实验验证其治疗原理及分子作用机制提供了先导信息和基础，也为研究成分更为复杂的中药复方的作用机制提供了借鉴。