H9N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法的建立

司振书 殷国政 路建彪

摘要：为H9N2亚型AIV进行快速、准确鉴定与诊断，根据H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因各设计1对引物，建立了一种对2个表面基因同时进行扩增的双重RT-PCR检测方法。HA、NA基因预期扩增的目的片段长度分别为700、423 bp。通过对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测，证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25 EID50/100 μL。采用该方法对H1～H15和N1～N9等亚型流感病毒及新城疫病毒等进行检测，结果只有H9N2亚型AIV出现2个特异性目的条带，与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的双重RT-PCR和病毒分离2种方法同时对送检样品进行检测，结果2种方法的符合率达99.77%，说明该检测方法特异性强、敏感性较高，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

关键词：禽流感病毒;H9N2亚型;双重RT-PCR;检测方法

中图分类号： S852.65+7  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0035-03

H9N2亚型禽流感病毒为中低致病力毒株，分布广泛，司振书等对山东省鸡群进行了H9亚型AIV的感染情况进行了调查，疑似流感病鸡病料RT-PCR阳性率为8.41%[1]。该病毒能造成鸡群的免疫抑制，如果与其他病原协同感染则可引起禽类严重发病，如与金黄色葡萄球菌混合感染可引起肉鸡发病，死亡率达6%[2]。2013年，我国发生了H7N9感染人事件，6个内部基因全部来自于H9N2 AIV[3-4]，1999年来发生了多次H9N2亚型AIV感染人的事件[5]，给人类健康带来威胁。禽流感病毒有多种检测方法，包括血凝（HA）、血凝抑制（HI）试验，神经氨酸酶抑制（NI）试验，琼脂扩散试验（AGP），酶联免疫吸附试验（ELISA），病毒的中和试验（NT），免疫荧光抗体技术（IFA）和real-time RT-PCR等。司振书等建立了针对H9亚型AIV的RT-PCR检测方法[6]，包红梅等建立了一步法RT-PCR检测方法，具有较好地特异性和敏感性[7]，但以上方法没有对NA基因进行扩增，不能确定NA亚型。司振书等对H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因分别进行扩增，操作较麻烦且多耗试验材料[8]。传统的血清学方法则需要多种亚型的血清和抗原，费时费力。根据H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因各设计1对引物，初步建立了一种针对H9N2亚型AIV的双重RT-PCR检测方法，该方法特异性强、敏感性较高。该试验于2012年在中国农业大学动物流感研究室完成。

1 材料与方法

1.1 毒株

H9N2亚型AIV标准参考毒株、H1～H15亚型AIV、N1-N9 亚型AIV、鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克氏病病毒及鸡痘病毒等毒株，由中国农业大学动物流感研究室保存并提供。

1.2 引物的设计、合成与筛选

针对HA、NA基因的保守区序列分别设计特异性引物，用Oligo 4.0软件分析上下游引物是否匹配，将分析合格的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司北京合成部合成。分别合成了针对HA、NA基因的5对引物，用H9N2亚型AIV进行筛选，根据扩增效率确定的引物对见表1。HA、NA基因扩增的目的片段长度分别为700、423 bp。

1.3 主要试剂

TRIzol Reagent，由Invitrogen公司生产;反转录试剂盒K1622，Fermentas;三氯甲烷、异丙醇、乙醇等均为市售;T4连接酶，由Promega公司生产;GoldenView、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，由北京索莱宝公司生产;Trans5K DNA Marker、DL2000DNA Marker、DH5α感受态细胞，由北京全式金生物技术有限公司生产;PMD-18T载体，由TaKaRa公司生产。

1.4 H9N2亚型AIV病毒含量的测定

取感染H9N2亚型禽流感病毒A/鸡/山东/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀释，每个稀释度接种3枚鸡胚，0.1 mL/枚。35 ℃孵育48 h，将鸡胚于4 ℃过夜，收获尿囊液，测定其血凝效价，按Reed-Muench法公式计算半数感染量。

1.5 病毒RNA的提取

Trizol法提取毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的RNA，立即作RT-PCR的扩增或-80 ℃保存备用。

1.6 cDNA的合成

按试剂盒说明书进行。

1.7 双重RT-PCR反应体系和反应条件的优化

对双重RT-PCR的反应体系和变性、退火、延伸温度和时间、循环次数等反应条件进行优化。最后确定采用总体积为25 μL的反应体系：2×PCR mix buffer12.5 μL;浓度为 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1.0 μL;HA下游引物H9-R 1.0 μL;浓度为20 pmol/μL NA上游引物N2-F 1.5 μL;NA下游引物N2-R 1.5 μL;ddH2O補足至25.0 μL。最后确定双重RT-PCR最佳循环条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，48 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，34个循环;72 ℃延伸10 min。

1.8 双重RT-PCR特异性试验

用建立的双重RT-PCR方法分别对H1～H15亚型AIV、N1-N9亚型AIV进行检测，以检测其他亚型病毒是否存在假阳性，即是否与其他亚型AIV具有交叉反应;用该方法对鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克氏病病毒及鸡痘病毒等毒株进行检测，分析该双重RT-PCR检测方法的特异性。

1.9 双重RT-PCR敏感性试验

对已确定病毒含量的毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液进行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀释度稀释，对不同稀释度尿囊液进行检测以确定其敏感性。

1.10 双重RT-PCR的应用

对送检的226份具呼吸道症状的病鸡病料和201份棉拭子样品用双重RT-PCR和病毒分离2种方法检测，以检测2种方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 病毒含量的测定结果

经测定H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液，病毒含量为1×107.25 EID50/100 μL。

2.2 H9、N2双重RT-PCR扩增结果

H9N2亚型AIV A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的双重RT-PCR扩增结果见图1，均获得700、423 bp的目的片段。

2.3 特异性试验结果

对H1～H15亚型AIV（其中H9 AIV为H9N2亚型）进行双重RT-PCR检测，H9N2亚型AIV扩增出700、423 bp的2个目的条带，其他亚型病毒均没有扩增出目的条带（图2）。对N1～N9等其他亚型（其中N2 AIV为H9N2亞型）AIV进行检测，H9N2亚型AIV扩增出700、423 bp的目的条带，其他亚型病毒均未出现条带（图3）。对NDV、IBV等其他病毒进行检测（图4）。H9N2亚型AIV扩增出700、423 bp的2个目的条带，而NDV、IBV等均无条带产生。结果表明，所建立的双重RT-PCR检测方法具有很强的特异性，可以特异性地检出H9N2亚型禽流感病毒。

2.4 敏感性试验结果

对不同稀释度的病毒液分别进行检测（图5）。在10-3稀释时，仍然可以扩增出2个明显的目的条带，说明该方法对病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25 EID50/100 μL，灵敏度较高、敏感性较强。

2.5 双重RT-PCR的应用

用建立的双重RT-PCR和病毒分离与血清学鉴定2种方法，同时对送检的226份具呼吸道症状的病鸡病料和201份棉拭子样品进行检测，结果2种检测方法的符合率达 99.77%（表1）。

3 讨论

H9N2亚型AIV在我国鸡群中分布广泛，并能引起人类感染，给养禽业和公共卫生造成重大影响，因此对其快速准确地鉴定非常重要。RT-PCR诊断技术可从基因水平检测AIV，具有较高的特异性和敏感性。建立的双重RT-PCR检测方法对H1～H15、N1～N9等亚型流感病毒，新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒等进行检测，只有H9N2亚型AIV出现2个特异性目的条带，其他亚型AIV与NDV等无任何条带，说明该方法对其他亚型AIV及NDV等无交叉反应，具有特异性;通过对不同稀释度的H9N2亚型AIV进行检测，证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25 EID50/100 μL，说明该检测方法敏感性较高;对送检的226份具呼吸道症状的病鸡病料和201份棉拭子样品进行检测，其结果与经典的病毒分离与血清学鉴定符合率达99.77%。

该方法H9、N2基因扩增所产生的目的条带分别为700、423 bp，相比而言，700 bp的条带更亮，而长度为423 bp的条带较暗，尽管对各引物浓度、模板用量、退火温度等因素进行了多次试验，反复优化，扩增片段仍然一明一暗，短的片段虽相比暗些，但条带明显，不影响结果的判断。建立的双重 RT-PCR 方法可对H9N2亚型AIV进行快速鉴定，该方法的建立为进一步进行试剂盒的研制打下了良好的基础，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

参考文献：

[1]司振书，李玉保，刘文强，等. 山东省鸡群H9亚型流感病毒的分离及其感染情况调查[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012（11）：98-100.

[2]邵 丹，张海涛，司振书. 肉鸡H9亚型禽流感与金黄色葡萄球菌混合感染的诊治[J]. 黑龙江畜牧兽医，2016（12）：125-126.

[3]Shi J Z，Deng G H，Liu P H，et al. Isolation and characterization of H7N9 viruses from live poultry markets—implication of the source of current H7N9 infection in humans[J]. Chinese Science Bulletin，2013，58（16）：1857-1863.

[4]Gao R，Cao B，Hu Y，et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J]. The New England Journal of Medicine，2013，368（20）：1888-1897.

[5]郭元吉，谢健屏，吴昆昱，等. 流感病毒A/广州/333/99（H9N2）毒株基因组特性的研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2002，16（2）：142-145.

[6]司振书，贾国富. H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定[J]. 江苏农业科学，2016，44（6）：64-66.

[7]包红梅，王秀荣，陶启蒙，等. H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2010，40（4）：384-389.

[8]司振书，朱明霞，王桂英. H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR鉴定方法的应用[J]. 黑龙江畜牧兽医，2016（05上）：19-21.耿鑫鑫，曾 焕，黄伊雪，等. 甘蓝型油菜主花序有效角果数QTL定位和候选基因筛选[J]. 江苏农业科学，2019，47（7）：38-41.