浮游态与生物膜态铜绿假单胞菌耐药性分析

刘春都,朱叶飞

(1.南京医科大学第二附属医院医学检验中心，南京 210011； 2.南京市浦口医院检验科，南京 210031)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)广泛分布于自然界，为条件致病菌，是医院及社区感染中较常见的病原菌，可引起多种感染性疾病，尤其是在免疫功能低下或缺陷的患者中感染更为常见，甚至还危及生命[1]。近年来，由于各种器械性和侵入性治疗手段，以及抗菌药物的广泛使用，其耐药率不断上升。2017年中国细菌耐药监测网显示，PA的分离率在革兰阴性菌中为第4位，在非发酵菌中为第2位，对抗生素的耐药率不断升高[2]。PA的耐药性愈加严重，引起PA的耐药机制也非常复杂，其中PA生物膜的形成是PA产生耐药的重要机制。据报道，医院获得性感染中30%是由PA引起，并且它极易形成生物膜，易对患者造成慢性持续性感染[3]。研究表明，65%～80%的人类细菌感染与生物膜有关，细菌的生物膜态对抗菌药物的耐药性显著高于浮游态[4]。本研究通过建立体外PA生物膜模型,比较生物膜态与游离态PA对抗菌药物的耐药性，为临床上预防和治疗生物膜感染提供思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 收集2017年1—12 月南京市浦口医院细菌室分离、鉴定的63株PA，所有菌株均按照《全国临床检验操作规程》第4版[5]的要求，分离、培养并经VITEK-60 微生物仪鉴定。去除相同部位的重复菌株。科室分布：重症监护病房30株，肿瘤科11株，呼吸内科9株，老年科6株，消化内科3株，血液科2株，内分泌科2株；标本来源：痰液34株，尿液10株、血液6株、脓液4株、分泌物4株、导管3株及胆汁2株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，购自国家卫生健康委员会临床检验中心。

1.1.2培养基 溶菌肉汤、水解酪蛋白培养基均购自法国梅里埃公司生产。

1.1.3试剂与仪器 0.1%结晶紫溶液、95%乙醇、磷酸盐缓冲液、药敏试剂和药敏纸片(购自法国梅里埃公司)、96孔平板，SpectramaxM3酶标仪、漩涡混合器、VITEK-60微生物鉴定系统(购自法国梅里埃公司)。

1.2方法

1.2.1PA复溶、增菌 将临床分离的PA从低温冰箱中取出解冻并接种于血平板，37 ℃过夜，挑取单个菌落接种到LB液体培养基中，37 ℃ 18～24 h培养增菌。

1.2.2PA生物膜体外构建 用标准比浊仪将增菌培养的PA调节成0.5麦氏单位浓度，取10 μL加入96孔板中(每孔含1∶50稀释的LB培养液200 μL)。每株菌做3个复孔，3个空白孔(不加菌液)，37 ℃培养72 h，每24小时更换溶菌肉汤培养液一次。

1.2.3结晶紫染色 细菌培养72 h后，在每个平板孔中加入150 μL 0.1%的结晶紫染液染色15 min，用缓冲液冲洗3次后晾干，每孔再加入95%乙醇150 μL脱色2 min[6]。

1.2.4生物膜定量检测及判断标准 用酶标仪测定每株菌的复孔OD570，对照管吸光度(comparison optical density,ODC)定义为空白对照孔的平均OD，加上标准差s,即ODC=OD空白+1s[7-8]。当待测菌OD值(OD测)≤ODC时，则无生物膜形成；当OD测>ODC时，则此菌株有生物膜形成。

1.2.5纸片扩散法药敏试验 按照《全国临床检验操作规程》第4版[5]的要求，用纸片扩散法进行PA浮游态及生物膜态的药敏试验，药敏结果依照2010年美国临床实验室标准化协会规定的标准判断耐药情况[9]。

1.2.6PA浮游菌最小抑菌浓度和PA生物膜菌最小生物膜清除浓度的测定 将临床常用的阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、头孢哌酮、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、环丙沙星12种抗菌药物分别在96孔板上采用微量稀释法测定浮游菌的最小抑菌浓度(即能抑制PA生长的最小药物浓度)：对形成生物膜的PA，在去除浮游菌后，在超声波震荡作用下，混匀器充分混匀后，微量稀释法测定最小生物膜清除浓度(即能清除PA生物膜的最小抗菌药物浓度)。

1.3统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1生物膜形成定量测定 将临床分离、培养、鉴定、收集的63株PA菌株经过96孔微量平板72 h培养，结晶紫染色法定量检测每株菌的OD值，结果有1株菌的ODODC形成生物膜，占98.4%。

2.2浮游态与生物膜态PA的耐药率 生物膜态阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、头孢哌酮、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、环丙沙星的PA耐药率均高于浮游态(P<0.01)，浮游态PA耐药率最低的是阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦，而生物膜态PA耐药率最低的是阿米卡星，其他均高于50%，其中最高的两种分别是对氨曲南和替卡西林/克拉维酸。见表1。

表1 浮游态与生物膜态PA药敏试验耐药率比较 [株数(%)]

PA：铜绿假单胞菌

2.3PA对抗菌药物的最小抑菌浓度、最小生物膜清除浓度的值 生物膜态PA的最小生物膜清除浓度值与相应的浮游态PA的最小抑菌浓度值相比明显增大，氨曲南、亚胺培南和替卡西林、克拉维酸的最小生物膜清除浓度值均超过检出限，生物膜菌最小生物膜清除浓度是浮游菌的10倍以上。见表2。

表2 PA浮游态最小抑菌浓度值与生物膜态最小生物膜清除浓度值 (n=62,μg/mL)

PA：铜绿假单胞菌

3 讨 论

细菌的生物膜指细菌黏附于机体腔道或物体的表面时分泌的含有多种蛋白多糖的复合物,以藻酸盐为主要成分的胞外多糖基质[10-11]，细菌分泌的胞外基质可将这些细菌粘连在一起形成具有一定空间结构的单种或多种细菌群体。生物膜的形成是一个动态过程，受到细菌密度感应系统的调控。密度感应系统是指在形成生物膜的过程中，细菌分泌一些分子物质到细胞外基质中，当达一定程度时就可激发一定的基因表达，这种情况就称为密度感应系统。PA有Las和Rhl两个密度感应系统,其中Las系统由LasR和LasI两个基因组成，Rhl系统由RhlR及RhlI基因组成[12-14]。细菌的密度感应系统与生物膜的形成密切相关，是生物膜形成过程中必不可少的。任何阻断密度感应系统的方法都可以阻止细菌生物膜的形成，这为治疗生物膜态PA感染提供了一个新的有效方法。

本研究结果显示，生物膜态阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、头孢哌酮、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、环丙沙星的PA耐药率均高于浮游态(P<0.01)，说明患者感染PA后一些临床常规的抗菌药物对PA有一定的杀伤作用，患者感染PA的症状有所好转，但随着患者住院时间增加以及有些患者各种导管、支架、留置针等的使用，PA菌株就黏附在这些物体表面或患者本身的腔道表面，经过反复的可逆黏附，PA菌株也不断增加，接着进入到不可逆黏附阶段，PA菌株在附着部位越积越多，分泌的胞外基质物质也越来越多，聚集的这些物质除细菌本身外，还含有水、细菌的代谢产物以及细菌变性、坏死、裂解的产物等，在多种因子的共同作用下，最后形成PA的生物膜。开始形成的生物膜在密度感应系统的作用下，膜中的细菌越来越紧密，膜本身也更加致密，最后形成成熟、稳固、具有一定三维结构的PA生物膜，这是一个动态过程[15-17]。

形成膜后的PA与浮游态的PA理化特点、生物学特征、基因构型均有所不同(浮游态PA与生物膜态PA至少有45个基因不同)，致病性也不同[18-19]。本研究耐药性试验结果显示，细菌形成生物膜后耐药性显著提高。与浮游菌相比，生物膜菌的耐药性大大提高，易引起难治性感染。常用的一些常规剂量的抗菌药物不仅不能起到抗菌杀菌的作用，反而易引起耐药性增加，给治疗带来极大的挑战。加强细菌耐药性的研究，特别是容易形成生物膜的PA的耐药性研究具有现实意义[11]。

本研究结果还显示，生物膜态PA的最小生物膜清除浓度值与相应的浮游态PA的最小抑菌浓度值相比明显增大，并且氨曲南、亚胺培南和替卡西林、克拉维酸的最小生物膜清除浓度值均超过检出限。可见PA形成生物膜后，其耐药性明显提高，说明生物膜形成是PA极易产生耐药的重要原因。生物膜产生耐药的机制非常复杂，主要体现为以下几点。①生物膜的阻挡作用：PA生物膜是以藻酸盐为主要成分的多糖基质，是具有空间结构的聚集物，是细菌抵抗外界环境的天然屏障，也可以阻挡各种抗菌药物进入细菌从而起到耐药作用。有学者通过光谱分析，观察到环丙沙星渗透进细菌生物膜的速度比渗透进相应浮游菌的速度降低显著[2]。但机械性的阻挡作用显然不是细菌生物膜耐药性升高的主要原因。有文献报道，氨苄青霉素可穿透有β-内酰胺酶突变体的肺炎克雷伯菌的生物膜，但此菌仍对氨苄青霉素耐药[20]。②生物膜基因表型的作用：细菌形成生物膜后，为了适应周围的环境，其生物学特性发生变化，形成了生物膜表型，原来抗菌药物的靶细胞结合的靶位改变，使得抗菌药物不能与它结合，导致细耐药性产生。③生物膜外排泵的作用：外排泵是位于膜上的一种蛋白质结构，它可以将进入细胞内的抗菌药物排出胞外，导致细菌的耐药性产生。PA对第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、头孢曲松、氨苄西林等药物天然耐药，主要机制是这些药物作用于PA时，使膜上的外排泵过度表达，药物排出增多，进入菌体内的药物不能达到有效浓度，导致耐药性产生。④密度感应系统的作用：密度感应系统在生物膜的整个形成过程中发挥关键作用，保证生物膜的形成与降解平衡，保持整个动态过程有序进行。一旦密度感应系统遭到破坏，生物膜的形成就会受到严重影响，该菌的生物学特性发生改变，耐药性也会变化。⑤氧气及营养物质的变化：细菌一旦形成了生物膜，生物膜就将它紧紧裹住，生物膜的致密结构阻碍了细胞内外物质的交换，细菌的代谢产物不能排出去，而细菌生长需要的各种营养物质也不能转运进来，PA为了适应环境生存下来，这些生物膜态的生物学性状就会发生改变，因此这些PA的耐药性也会变化。此外，膜上的位点、靶位、通道及酶发生改变对PA的耐药性都有直接影响。随着对细菌生物膜的深入研究还会有新的机制提出。同时生物膜对任何一种药物的耐药均是多种机制综合作用的结果[21]。

综上所述，由于生物膜PA对临床常规抗菌药物的耐药性严重，在临床上应尽量避免生物膜的形成，防止细菌生物膜的感染。对于使用器械性材料的病患应该使用敏感的抗菌材料，抑制相应的细菌黏附和生长，阻止生物膜的形成，此外抑制细菌群体感应系统，联合用药为当前治疗生物膜感染的重要方法，同时中草药、物理、生物等方法也可用于临床，防止生物膜形成[22]。