实时荧光定量PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的比较

修 敏，任妍妍

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病 。为进一步了解流感病毒流行株构成、基因特异性以及抗原性，避免流感大面积扩散，各地均实施了有效的监测[1-2]，国际上第一个实现全球监测的疾病是流感，对有效控制和预防流感起到很大作用[3]。本研究针对实时荧光定量PCR、细胞培养法在流感病毒检测中的应用效果进行分析，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 研究样本来源于阜新市卫生健康服务中心2016年12月—2017年5月流感高峰季节接收的流感样本726例，所选样本均在24 h内送至检测实验室进行检查，对于无法在24 h内送检的样本，应置于-70 ℃的环境中保存。

1.2 仪器与试剂 本次研究中所用的仪器：Ⅱ级生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司，型号BSC-1500ⅡA2-X）；高速离心机（美国贝克曼Microfuge公司，型号18）；全自动实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司，型号7500fast）；旋涡振荡器（德国Heidolph公司）；全自动核酸提取仪（德国GIAGEN公司，型号QIAcube）；核酸提取试剂盒（德国GIAGEN公司，型号RNeasy Mini Kit）；无核酸离心管；CIBIO公司DMEM培养液；甲型/乙型流感病毒核酸RNA检测试剂盒（江苏硕世生物科技有限公司）。

1.2.1 核酸提取 根据QIAcube全自动核酸提取仪使用说明书和配套RNA提取试剂盒的使用方法进行试验[4]。

1.2.2 反应的体系以及条件 采用甲型/乙型流感病毒核酸RNA检测试剂盒。反应体系包括：反应液、反转录酶，所有反应体系的配置情况均以试剂盒的说明书为依据进行。反应条件：在50 ℃下进行30 min，按照此顺序进行1个循环然后在95 ℃下进行5 min，按照此顺序进行1个循环，在95 ℃下进行10 s，然后在55 ℃下进行40 s，按照此顺序进行45个循环，最后为荧光收集，在55 ℃的环境下进行荧光检测。

1.2.3 病毒细胞分离鉴定 根据《流行性感冒诊疗方案（2018 年版修订版）》[5]对流感病毒实施鉴定和分离操作。将10 000 U/ml双抗置入到样本病毒采样液，对细胞病理变化进行观察，通过红细胞凝集试验对病毒培养液进行检测，对于红细胞凝集试验滴度达到1∶16或者超过该比例的细胞培养液，利用红细胞凝集抑制试验对相关亚型标准血清进行检测和鉴定[6-7]。

1.3 统计学处理 用SPSS 20.0软件处理数据，计算相应的阳性率。以细胞培养为金标准，计算实时荧光定量PCR检测法诊断流感的灵敏度和特异度。

2 结 果

2.1 细胞培养法以及实时荧光定量PCR检测法检测流感病毒阳性率 细胞培养法检测阳性标本89例，阳性率12.26%，实时荧光定量PCR法共检测189例阳性，阳性率26.03%。细胞培养法A型H1、H3亚型以及B型阳性检测率分别是0.96%、4.82%和5.65%；实时荧光定量PCR法检出A型H1、H3亚型以及B型阳性率分别是1.52%、10.33%和11.57%。见表1。

表1 细胞培养法和实时荧光定量PCR检测法检测流感病毒阳性结果[例(%)]Table 1 Positive results of influenza virus by cell culture and real-time fluorescence quantitative PCR[cases(%)]

2.2 实时荧光定量PCR检测法的灵敏度和特异度 以细胞培养法为金标准，实时荧光定量PCR检测法灵敏度为91.01%（81/89），特异度为83.05%（529/637）。见表2。

表2 细胞培养法和实时荧光定量PCR检测法检测流感病毒结果（例）Table 2 Results of influenza virus by cell culture and realtime fluorescence quantitative PCR(cases)

3 讨 论

目前分离培养法、PCR检测法都是检测流感病毒的主要方法。细胞培养方法是目前检测流感病毒的金标准，同样也是检测流感病毒的主要方法和基础，但是其无法实现快速诊断的目标[9-10]。PCR检测可以准确、快速地检测流感病毒，而且是一种切实可行的方法，该方法具有较快的检测速度，而且具有较高的灵敏度，无论样品质量高低均能够进行检测[11]。

本研究共收集726例样本，细菌培养阳性89例，阳性率为12.26%，实时荧光定量PCR法阳性189例，阳性率为26.03%。细胞培养A型H1、H3亚型以及B型阳性检测率分别是0.96%、4.82%和5.65%；实时荧光定量PCR法检测A型H1、H3亚型以及B型阳性检测率分别是1.52%、10.33%和11.57%。细胞培养法在样本采集时间、样本运输、样本活病毒含量以及保存等方面均存在较高的要求。PCR法检测标本的病毒核酸，无论是病毒降解物还是病毒，都能够检出病毒RNA，所以在实际检测过程中，PCR阳性检出率要比培养法高[12-13]。建议将2种检测方法结合在一起，以提高检出率。

实时荧光定量PCR检测法具有灵敏度高、检出速度快等特点，可被广泛应用于临床诊断、常规监测以及流感疫情应急检测中。细胞培养法能够取得病毒毒株，可用于研究耐药性、基因特性以及抗原性等。