ELMO1基因甲基化检测在胃癌早期诊断中的价值

宋 健，黎 萍，袁桂红，贾 真，张荣琳，王发宝，钟国柄，李依倪，钟敦璟

宋健，黎萍，袁桂红，张荣琳，李依倪，钟敦璟，海南省肿瘤医院消化内镜科 海南省海口市 570123

贾真，海南省肿瘤医院麻醉科 海南省海口市 570123

王发宝，海南省肿瘤医院病理科 海南省海口市 570123

钟国柄，海南省肿瘤医院中心实验室 海南省海口市 570123

核心提要： 胃癌(gastric cancer, GC)组织及胃液DNA中吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1, ELMO1)基因启动子区均呈高甲基化状态, 在早期GC中即明显升高, 具有较好的特异性和敏感性. ELMO1基因甲基化异化可作为GC早期诊断的分子靶标, 检测胃液DNA中ELMO1基因甲基化异化可用于GC的早期诊断.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一种消化道常见的恶性肿瘤,其发病率在我国居第二位, 死亡率居第一位, 早期诊断困难. GC的发病机制与基因启动子甲基化等表观遗传学改变密切相关[1-3], 近几年国外有研究表明, 吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)基因在GC患者中呈高甲基化状态, 但能否作为GC的分子诊断靶标尚无定论[4,5]. 胃液中含有大量的胃黏膜脱落细胞及其DNA, 检测胃液中的DNA甲基化能较病理活检具有更好的敏感性[6]. 本研究对慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、GC患者病理组织及胃液中ELMO1基因甲基化水平进行检测, 旨在探讨ELMO1基因甲基化能否作为GC的分子诊断标记物, 为GC的早期诊断提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例入组及取材： 本研究选取2017-01/2018-08海南省肿瘤医院内镜中心诊治的胃病患者77例, 其中男性40例, 女性37例, 年龄35-75岁, 平均年龄56.3岁±12.5岁；所有患者在此之前均未接受放射、化学治疗及生物免疫治疗. 纳入标准： 经病理诊断为慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎及GC患者, 前两组各20例. GC组37例, 其中早期GC15例及进展期GC22例. 胃炎的诊断标准按中华医学会消化病学分会. 中国慢性胃炎共识意见(2017年, 上海)[7], GC的诊断标准按中国临床肿瘤学会. 原发性GC诊疗指南(2017.V1)[8]. 排除患有其他系统肿瘤、其他胃肠系统疾病及其他器官衰竭等疾病的患者. 在胃镜检查过程中用集液器收集每例患者胃液10 mL置于15 mL冻存管, 同时用活检钳钳取每例患者的病理组织,胃炎患者病理标本取胃窦、胃体各2块, GC患者取病变部位5块, 距离病变部位5 cm处2块. 胃液标本-80 ℃保存备用, 胃炎组织标本留取胃窦1块10%甲醛固定行病理检查, GC组织标本留取2块10%甲醛固定后行病理检查,其余组织标本-80 ℃保存备用. 此研究符合医学研究伦理规范, 获海南省肿瘤医院伦理委员会批准, 所有患者知情同意并签署知情同意书. 三组患者在一般基线资料上无明显差异(P＞0.05), 具有可比性(表1).

1.1.2 主要仪器和试剂： PCR扩增仪(Long Gene公司MyGene MG96+型)； 离心机(北京京立离心机有限公司LG16-WA型)； 凝胶电泳仪(北京六一仪器厂DYY-6C型)； 凝胶成像仪(Gel Ocumentuteon systern Beosens SC 805型). EZ DNA Methylation-GoldTMKit (zymo research Catalog Nos. D5005)； ZymoTaq PreMix (zymo research Catalog Nos. E2003)； Quick-DNATMUniversal Kit (zymo research Catalog Nos. D4068)

1.2 方法 将各组胃液于4 ℃, 1000 g, 离心10 min, 弃掉沉渣留上清液, 将上清液再次于4 ℃, 10000 g, 离心20 min,留取沉淀物用于DNA抽提. 各组组织样本保存在DNA保护剂中, 提取DNA. 步骤详见说明书Quick-DNATMUniversal Kit (zymo research Catalog Nos. D4068). DNA纯度分析采用核酸蛋白分析仪, 采用凝胶电泳进行质量检测. 之后进行DNA亚硫酸盐修饰, 针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物, 进行PCR扩增, 引物序列(表2). 本研究采用双蒸水作为空白对照. PCR反应采用ZymoTaqTMPre Mix试剂盒, 反应体系为25μL, 反应条件为： 95 ℃, 预变性5 min, 循环体系为94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共进行40个循环, 之后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测.

统计学处理本研究数据采用SPSS 22统计学软件进行分析, 计量资料以mean±SD表示, 采用t检验； 计数资料采用卡方检验、Mann-WhitneyU检验及Fisher's精确检验,P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 各组病理组织中ELMO1基因甲基化水平 各组病理组织中ELMO1基因MSP电泳结果(图1和图2). 慢性非萎缩性胃炎组、慢性萎缩性胃炎组、GC组及癌旁组织ELMO1基因甲基化率分别为0%、20%、93.3%、96.7%, 前三者两两比较差异显著(P＜0.01)； GC与癌旁组织DNA中无显著差异(P＞0.05).

2.2 各组胃液中ELMO1基因甲基化水平 各组胃液中ELMO1基因MSP电泳结果(图3). 在胃液DNA中ELMO1基因甲基化率分别为： 慢性浅表性胃炎组0%, 慢性萎缩性胃炎组10%, GC组76.7%, 前二者比较显著差异(P＜0.05), 前两者分别与GC组比较差异显著(P＜0.01). 早期GC与进展期GC患者胃液ELMO1基因甲基化率分别为73.3%、80.0%, 两者比较差异不显著(P＞0.05).

2.3 GC患者ELMO1基因启动子区甲基化与临床病理因素的关系 15例早期GC与22例进展期GC患者组织中ELMO1基因甲基化率分别为86.7%、100%, 两者无显著差异(P＞0.05), 与肿瘤临床分期、大小及淋巴结转移等无明显相关性(表3).

统计分析： Mann-WhitneyU检验(年龄)； Fisher's精确检验(性别, 肿瘤分期, 肿瘤大小, 淋巴结转移)

3 讨论

近年研究表明, 早期GC患者的5年生存率超过90%, 中晚期GC患者的5年生存率则降至20%-30%[9,10]. 早期干预对于GC患者具有重要意义, 但由于缺乏GC早期的独特临床诊断特征及指标, 早期GC的诊断率不到15%, 多数患者确诊时已处于中晚期, 大大降低了生存率, 因此,寻找有效的早期诊断指标对于提高GC患者的生存率具有重要意义[11,12]. 目前GC的早期诊断依赖于对包括慢性胃炎黏膜萎缩、肠上皮化生及异常增生等在内的癌前病变的追踪随访. 近年来研究发现, 以DNA甲基化为代表的表观遗传学可在肿瘤的诊断及预后中具有重要作用[13,14].ELMO1基因, 是进化上非常保守的一种序列, 主要介导细胞的吞噬、移动和形态改变.ELMO1在包括肺癌、乳腺癌、食管腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、横纹肌肉瘤和神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中有不同程度的异常表达, 且与肿瘤的临床分期及预后密切相关, 是与肿瘤细胞迁移相关的基因之一[15-20], 其在GC发生中的作用机制还不清楚.

表1 患者的一般资料情况

表2 ELMO1引物序列

图1 非萎缩性胃炎及萎缩性胃炎组织ELMO1甲基化特异性PCR电泳结果.

图2 胃癌及癌旁组织ELMO1甲基化特异性PCR电泳结果.

表3 胃癌ELMO1甲基化与临床病理因素关系

图3 ELMO1甲基化特异性PCR检测各组胃液中的结果.

GC的甲基化异化基因能否作为GC的分子诊断靶标文献报道较少, 目前还没文献报道有明确可靠的甲基化分子靶标用于GC的基因诊断. 2017年Pirini等[4]报道,通过对胃镜活检标本进行全基因组甲基化指数(GDMI)及联合检测IRF4,ELMO1,CLIP4and MSC启动子区甲基化, 发现GDMI大于4及RF4,ELMO1,CLIP4and MSC启动子区高甲基化对于GC风险的预测具有较大的价值.

胃液中含有大量的胃黏膜脱落细胞及其DNA, 易于获取, 是进行GC分子诊断的良好标本. 在我国人口众多, GC是高发肿瘤, 但现有的GC筛查方法包括血清学及胃镜检查费用较高, 且不易在人群中推广和接受,如能在胃液中找到理想的GC诊断分子靶标, 通过胃管法获取胃液进行GC分子靶标的检测, 对于人群GC的筛查具有更好的接受度和社会经济效益比. 2016年Yamamoto等[6]报道, 通过对GC患者组织及胃液DNA中BARHL2基因甲基化研究发现：BARHL2基因甲基化异化在GC患者中敏感性达到90%, 特异性达到100%, 但未见后续研究报道. 我们也进行了该基因的类同研究, 但结果是BARHL2基因在GC、癌旁及慢性胃炎中均呈高甲基化状态, 没有特异性, 不能作为GC的分子诊断靶标.

本文研究了ELMO1基因在慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎及GC和癌旁组织及相应胃液中该基因甲基化情况, 及其与GC患者肿瘤分期、淋巴结转移及预后的关系. 研究结果表明： GC患者病理组织及胃液DNA中ELMO1基因启动子区均呈高甲基化状态, 并有较高的一致性, 并且在早期GC中即明显升高, 在慢性非萎缩性胃炎患者中无甲基化发生, 在慢性萎缩性胃炎患者中有少量甲基化发生, 在GC患者中ELMO1几乎均发生甲基化, 提示ELMO1基因甲基化可作为GC的分子诊断靶标. 我们的研究结果表明在早癌GC患者胃液中进行ELMO1基因甲基化检测具有较高的敏感性和特异性,可作为早期GC的诊断方法.ELMO1在萎缩性胃炎的患者中也有20%的甲基化率, 提示该基因甲基化对GC的发生有一定的预警作用. GC患者ELMO1基因启动子区甲基化与性别、临床病理分期、肿瘤部位及淋巴结转移等无明显相关性. 另外癌旁组织中ELMO1基因同样发生高甲基化, 并与癌组织基本一致, 其发生机制尚不明确, 需要进一步研究.

综上所述,ELMO1基因启动子区甲基化在GC组织中具有很高的发生率, 并且在早癌GC中既可发生, 可作为GC早期诊断的分子靶标. 在胃液中检测ELMO1基因甲基化可用于GC的早期诊断； 在胃镜检查的同时留取胃液检测ELMO1甲基化的改变有助于提高GC的诊断率及预测GC的发生风险. 同时, 可通过胃管法留取胃液进行GC的无症状人群筛查, 避免胃镜检查的痛苦及提高经济社会效益.ELMO1基因启动子区CpG岛也可作为GC治疗的一个潜在药物靶点, 为GC的早期诊断和治疗提供新的思路与理论依据.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer, GC)是我国发病率和死亡率分别位于第二位和第一位的恶性肿瘤, GC的预后与诊断时的疾病阶段密切相关. 在早期发现时, GC通常是可治愈的,5年生存率大于90%, 而晚期GC的预后很差, 5年生存率仅为20-30%. 早期GC被定义为癌组织局限于胃黏膜或黏膜下层(不论有无淋巴结转移), 由于没有特异性症状,仅有不到20%的GC被诊断为早期GC. 胃镜是目前GC早期诊断的金标准, 但由于我国人口众多、胃镜检查接受度差及内镜医师缺乏等, 不能作为GC早筛、早诊的手段. 近年来肿瘤基因甲基化的研究为肿瘤早期诊断带来了曙光, 部分肿瘤的甲基化基因诊断已进入临床应用,并取得了较好的经济社会效益. 近年有文献报道吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)基因在GC患者中呈高甲基化状态, 但能否作为GC的分子诊断靶标尚无定论. 本文对慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、GC患者病理组织及胃液中ELMO1基因甲基化水平进行研究, 旨在探讨ELMO1基因甲基化能否作为GC的分子诊断标记物以及胃液能否用于检测标本.

实验动机

本文研究的主题是ELMO1基因在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、GC组织及胃液DNA中甲基化异化情况. 拟解决的关键问题是ELMO1基因甲基化异化是否具有GC特异性和敏感性, 在胃液DNA中可否检测到ELMO1基因甲基化异化, 以及其能否作为GC的分子诊断靶标. 问题的解决将为GC的早期诊断提供一种新的方法.

实验目标

本研究的主要目标是ELMO1基因甲基化异化是否具有GC特异性和敏感性, 对于早期GC是否具有诊断价值,以及胃液可否用于ELMO1基因甲基化异化的诊断标本.如实验达成这三个目标, 将为早期GC的分子靶标诊断研究及临床应用奠定基础.

实验方法

以慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、GC患者(包括早期GC及进展期GC)为研究对象, 胃镜检查同时收集胃液及组织标本. 通过甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测三组患者组织及胃液DNA中ELMO1基因甲基化水平, 并进行组间对比分析, 并分析ELMO1基因甲基化异化与GC的发生、分期及转移的关系等.

实验结果

本实验的结果是ELMO1基因甲基化率在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎及GC组分别为0%、20%、93.3%,差异显著(P＜0.01)； 在胃液DNA中依次为： 0%、12.3%、76.7%, 差异显著(P＜0.05). 癌旁组织DNA中ELMO1基因甲基化率为96.7%, 与GC组比较差异不显著(P＞0.05)； 早期GC与进展期GC患者组织中ELMO1基因甲基化率分别为86.7%、100%, 两者胃液中ELMO1基因甲基化率在分别为73.3%、80.0%, 两者在胃液及组织中比较均无显著差异(P＞0.05).ELMO1基因甲基化异化与GC的临床分期、大小及淋巴结转移等无明显相关性. 本实验达成了实验目标,ELMO1基因甲基化异化在GC患者组织及胃液DNA中具有较高的特异性和敏感性, 为早期GC的分子靶标诊断研究及临床应用奠定了基础.

实验结论

GCELMO1基因启动子区甲基化异化具有特异性, 在GC组织及胃液中检测其甲基化异化具有敏感性, 并且在早期GC中也具有较高敏感性,ELMO1基因甲基化可作为GC早期诊断的分子靶标, 并且胃液可作为ELMO1基因甲基化检测的良好标本. 本研究为GC的分子靶标诊断及临床应用进行了探索, 为以后GC甲基化分子靶标在粪便及血液等标本的检测研究奠定了基础.

展望前景

本研究入组实验样本数偏少, 需要进一步扩大样本量验证实验结果, 需要更进一步细化研究, 如慢性萎缩性胃炎中不典型增生或肠上皮化生与早期GC的差异, 为临床提供更科学的数据支撑. 下一步将扩大样本量研究,并进一步研究血液及粪便中该基因甲基化异化情况, 并建立该基因甲基化高通量定量检测方法, 为临床应用奠定基础.