膝关节骨关节炎诱导性动物模型研究进展

沈景寿 张晶 胡毓诗 沈海

1 成都体育学院（成都610041）

2 四川省骨科医院（成都610041） 3 成都第一骨科医院（成都610031）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是临床上影响中老人生活质量的慢性关节疾病之一。随着人口老龄化的加剧，KOA的发病率也逐年上升，耗费了巨大的社会医疗资源。因此，对该病的研究刻不容缓，而建立理想的动物模型是研究KOA 病因病机的基础。但是目前可用于该病研究的动物模型不多，缺少对该病动物模型的系统归纳、比较分析。KOA 动物模型主要包括诱导性、自发性两种。诱导性动物模型具有实验用时短、研究针对性强、成功率高等优点。自发性动物模型由于实验研究耗时长，研究结果不稳定，故较少应用[1]。

本文以“膝骨性关节炎、动物模型、动物造模”为中文检索词，以“knee osteoarthritis and animal models or animal modeling”为英文检索词，通过万方、知网、Pubmed 数据库，检索相关文献，对国内外KOA 诱导性动物模型的建立方法进行总结归纳，为后期KOA 科研提供参考。

1 动物模型的建立

目前国内外对KOA 动物模型建立分类的表述方式较多。本文主要从手术创伤和理化生因素两方面进行表述。其中手术创伤包括膝内创伤与膝外创伤；理化生因素包括物理因素、化学因素、生物因素。诱导性动物KOA模型建立分类见图1。

图1 诱导性动物KOA模型建立分类

1.1 手术创伤模型

1.1.1 膝关节内诱导模型

1.1.1.1 传统Huith法与改良Huith法

传统Huith 法：切除膝关节前交叉韧带、后交叉韧带、内侧副韧带以及摘除内侧半月板。该法作为KOA经典的手术造模方法，在1970年由Hulth等[2]提出。邓紫婷等[3]采用Hulth法对模型组的10只大鼠进行手术，术后给予抗生素预防感染7天，造模1周后每天迫使大鼠跑步，每次30 分钟，跑步维持4 周获得成功的模型。韦健等[4]采用Hulth 法，术中关节腔内滴注庆大霉素抗感染。不固定兔子术肢，并驱赶兔子行走30～60 min/d，6 周后出现软骨缺损，边缘骨赘形成，成功建立家兔KOA模型。

改良Huith法：在传统Huith法基础上稍做改变，完成KOA 动物造模实验。Candace 等[5]对11 只羊采用改良Huith法剥离内侧半月板前角和体部，破坏内侧半月板的稳定性，出现膝关节软骨损伤、裂缝、侵蚀，甚至骨赘，成功建立KOA 模型。有学者[6，7]对传统Huith 法进行改良，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带、内侧副韧带，保留了后交叉韧带；或者摘除内侧半月板，切断前交叉韧带，保留内侧副韧带与后交叉韧带。术后关节软骨破坏，结构紊乱，证明改良Huith 法是建立KOA 动物模型的理想方法。

传统Huith 法因造模不稳定、所需时间长、造模成功率低等缺点而限制其在临床上的推广。改良Huith法较传统Huith 法复制时间短、造模成功率高，临床上更多应用于膝关节创伤后KOA的相关研究。

1.1.1.2 半月板摘除法

张荣凯等[8]采用手术方法切除大鼠膝关节内侧半月板及内侧副韧带，保留交叉韧带的完整性，维持关节稳定性，在4周后成功建立了大鼠KOA早期模型，是研究早期KOA 的理想动物模型。祁雷等[9]通过切断内侧副韧带及内侧半月板，建立KOA 模型。术后4 周观察到关节软骨面变粗糙、光泽暗淡；术后6周关节软骨糜烂并伴骨赘生成；术后8 周关节面溃疡并有大量骨赘形成。研究认为通过该方法可以成功复制KOA 不同时期的病理特征。

1.1.1.3 关节内软骨划痕法

关节内软骨划痕法是通过手术在膝关节软骨上造成划痕，破坏软骨表面结构，造成软骨损伤的一种实验方法。段鑫等[10]对比格犬的股骨髁软骨进行刮除，不破坏软骨下骨，术后注射抗生素抗感染。术后16周可见关节软骨明显缺损，色泽呈暗红色改变，软骨缺损部位长入有少许纤维组织，成功达到了KOA造模效果。

1.1.1.4 前交叉韧带切断法

前交叉韧带切断法是一种结构破坏少、创伤小、操作简单的造模方法。刘振龙等[11]采用前交叉韧带切断术，术中切断前交叉韧带并剪掉其2 mm 防止愈合，术中查Lachman试验、前抽屉试验阳性。术后抗感染，自由活动。术后4周表现为软骨面不光整；术后6周软骨面出现轻度糜烂；术后8周软骨面糜烂严重，软骨下骨外露。有研究[12]对豚鼠行单纯前交叉韧带切断术造模，术后给予高频振动干预，加速软骨退变，缩短造模时间。

1.1.2 膝关节外诱导模型

1.1.2.1 关节外血循阻断法

关节外血循阻断法系采用结扎或切断关节外的血管，阻断动物下肢大部分的血液回流，造成膝关节周围骨内持续高压，骨内动脉灌注减少，静脉回流受阻，氧供不足，酸性产物堆积，影响软骨组织的营养供给，加速软骨组织的退行性改变。戴七一等[13]采用血管双重结扎法结扎兔子下肢股静脉、大隐静脉、臀下静脉。术后8 周光镜可见：软骨表面局部凹凸不平，缺损及裂隙，软骨变薄，可见灶性崩解、坏死，潮线部分消失，成功造模。

1.1.2.2 关节外应力改变法

关节外应力改变法系一种不侵入关节腔，感染几率低，且创伤小，出血少的造模方法，适合早中期关节软骨病理改变的观察[14]。

朱鸿飞等[15]通过关节外应力改变的方法切除实验兔的双侧中内2/3髌韧带。术后1周兔被迫活动，术后6 周出现早期关节退行性改变，术后8 周表现为中期的病理改变。王胜等[16]采用髌韧带延长法，通过对术肢生物力线的改变减轻关节压力，术后6 周关节滑膜增生水肿，术后12周软骨层变薄，软骨面轻度糜烂。

1.1.2.3 卵巢切除法

卵巢切除法是一种通过雌激素对关节软骨的作用导致关节退变的造模方法。王文胜等[17]对模型组采用切除双侧卵巢，术后联合上坡训练。术后8周，单纯卵巢切除组可见软骨基质代谢异常，潮线模糊；卵巢切除联合上坡训练模型组可见潮线模糊，软骨裂隙。卵巢切除联合上坡训练可高效建立KOA模型。

1.2 理化生因素

1.2.1 物理因素

1.2.1.1 冷冻法

冷冻法系指膝关节在寒冷的环境刺激下，通过关节软骨受损、滑膜水肿充血而诱导骨关节炎的方法。林强等[18]采用寒冷刺激联合固定的方法制作大鼠KOA模型。将大鼠双膝置于约4℃的水中，每天在石膏外固定的协助下维持4 h。造模6 周后髌股关节面出现不光滑，关节间隙变窄，膝周软组织肿胀，甚至可见少量骨赘。有研究[19]采用同样的方法，水温设置在6℃，也成功建立了大鼠KOA 模型。通过冷冻刺激大鼠建立KOA 模型，应注意预防动物患肢被冻坏、溃烂感染、缺血坏死等意外发生。

1.2.1.2 关节制动法

通过对模型肢体关节外的制动，使骨骼肌萎缩，软骨细胞凋亡，形成不可逆的KOA。朱芳晓等[20]采用石膏外固定，患肢制动造模8 周后成功建立KOA 模型。摆雪等[21]采用石膏联合铁丝加固石膏外固定法建立兔KOA模型，固定8周后，成功观察到KOA的病理组织改变。

关节制动法避免了手术所致创伤性的影响，符合用进废退的自然规律，符合骨关节炎的病理进程。但由于长时间的石膏外固定，易使局部肿胀，严重者出现张力性水泡及皮肤溃烂等并发症。因此应加强患肢护理，可考虑在石膏与皮肤之间加用棉垫，并且定期更换，检查局部皮肤情况，积极预防并发症。

1.2.1.3 异物置入法

研究者向模型膝关节内置入异物等也可导致关节软骨退变，形成骨关节炎模型[22]。

1.2.2 化学因素

1.2.2.1 关节腔内注射木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶关节腔内注射造模方法为目前常用的造模方法，造模周期短，能模拟软骨破坏的终末环节。张红等[23]于大白兔膝关节腔内注射1.6%木瓜蛋白酶溶液0.3 ml，1次/3天，连续3次。3周后出现关节软骨表面较粗糙，局部软化、溃疡，滑膜充血水肿等病理改变。张镇等[24]以2%、5%、10%不同浓度的木瓜蛋白酶和0.03 ml/L L-半胱氨酸混合液注射入大鼠关节腔内，2 周后得到不同程度软骨损伤的KOA 模型。还有多个研究[25-28]使用不同浓度的木瓜蛋白酶以及与其他化学物质联合，在不同动物的膝关节腔内注射，均成功建立KOA动物模型。

1.2.2.2 关节腔内注射胶原蛋白酶

Seo 等[29]为了研究电针与阿片类药物对关节炎的止痛效果，采用胶原蛋白诱导关节炎的方法在大鼠膝关节腔内注射0.05 ml 的4 mg/ml 胶原酶溶液，4 天后加注1 次。4 周后可观察到类似人类KOA 的病理组织改变。刘军等[30]总结了采用胶原酶关节腔内注射的方法建立的KOA 模型。采用Ⅱ型胶原酶以及Ⅲ型胶原酶造模时，成功造模耗时短，术后3 天后可以观察到KOA的病理改变，缩短实验周期。

1.2.2.3 关节腔内注射碘乙酸盐

杜明泽等[31]单次向实验大鼠的膝关节腔内注入碘乙酸钠3 mg/50 μl，造模后2 周可形成类似人体KOA病理改变的过程。俞光平等[32]将50 μl 碘乙酸钠溶液注入大鼠关节腔内诱导KOA 模型，6 周后模型组大鼠膝关节软骨结构紊乱、碎裂、软骨坏死等，成功建立了KOA模型。

1.2.2.4 关节腔内注射尿激酶

石辉等[33]于24只大白兔膝关节腔内注射一定浓度的尿激酶，在诱导后第4、8、12 周分别取兔膝关节滑膜组织进行病理组织学观察。肉眼观察结果显示：4周滑膜、软骨无明显改变；8 周滑膜增生、软骨变淡黄；12周滑膜增生明显，软骨表面粗糙、软化灶。光镜观察结果显示：4周出现急性炎症反应；8周出现急性、慢性炎症并存；12 周出现慢性炎症修复。电镜观察显示：12周膝关节软骨细胞水肿、坏死、减少，软骨变薄，软骨面不光整。

该造模方法诱导处的KOA 症状不明显、时间周期长，后续研究较少。这可能与注射尿激酶的浓度以及实验观察时间存在一定关系，尚有待进一步研究。

1.2.3 生物因素——细胞工程学造模

于斐等[34]在建立特异性膝骨关节炎模型中将高龄小鼠沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）基因敲除，成功建立了SIRTl 基因敲除膝骨关节炎小鼠动物模型，该项技术为以后KOA 的研究提供便利条件。通过细胞工程学中的细胞编辑技术，从基因水平来建立KOA 模型，达到预期的造模目标，为KOA造模开辟了新路。

2 动物模型的选择

动物模型的选择原则为相关性、适当性和实用性。相关性是指动物模型的特点和人类疾病的特征存在关联的关系；适当性是指根据实验目的和要求选择合适的动物种类；实用性是指应考虑模型监管、来源、维护条件、费用等。兔、鼠价格相对便宜，并且容易获得，适用于各类模型的研究，是动物造模首选物种。但羊、狗、猴等费用较高，操作相对困难，以及受到实验伦理的约束，适用度相对较低。

2.1 造模动物种类的选择

多项研究[35-37]针对KOA 造模的动物种类选择，归纳总结了各种动物的优缺点，以便研究者基于不同的目的，选择合适的动物。总结如表1。根据目前的实际情况，我们认为使用大鼠或兔来造模，可满足模型选择原则，是目前比较符合实际的建模动物之一。

表1 不同动物造模研究优缺点[35-37]

（续表1）

2.2 模型成功周期的选择

KOA的动物造模中，造模方式不同，造模成功周期长短不一。不同造模方法的成功周期见表2[17，38]。最快的KOA 成功造模方式为关节腔内注射药物，特别是向关节腔内注射木瓜蛋白酶来建立模型，可达到多、快、好、省。在造模时间的控制上，改良Huith法提示，增加患肢的负荷可以缩短造模时间。研究者应根据预期的研究设置，选择合适的方法来完成造模。

2.3 模型适用范围

陈世杰等[39]总结了各类骨关节炎动物模型的适用范围，见表3。不同的造模方法有不同的研究适应范围，研究者可以根据预期的研究目的，选择合适的造模方法。

表2 不同造模方法的成功周期[17，38]

表3 不同造模方法的适用范围[39]

3 总结与展望

本文针对KOA 动物模型的建立方法进行总结归纳，并对不同动物种类模型优缺点、不同造模方法的成功周期、不同造模方法的适应范围进行归纳。通过分析比较发现，关节内手术模型的优点为造模时间短，稳定性好，当前应用较广；但也不可忽视其不足，即存在手术创伤，不适宜观察早期KOA 病变和生化代谢方面变化。关节外手术模型避免了关节内手术创伤，减少炎症、出血反应的干扰，是观察KOA 早期病理变化和药物筛选的理想模型，但目前临床应用较少。关节腔内注射药物或化学物质刺激膝关节内快速形成类似人类KOA 终末期软骨病理改变，造模时间短，有别于自然形成关节炎和创伤后的关节炎，适用于膝关节软骨病理研究，且在药物防治、疗效、筛选等方面有明显的研究优势，不适合于自发性或创伤后的骨关节炎研究。关节制动法和冷冻法符合人类临床KOA 病理过程。细胞工程学的前沿科技手段前景可期，其技术要求高，资金昂贵，结果尚不稳定，目前较为少用，但作为新兴技术，具有广泛的发展前景。